液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术凭借高特异性、高灵敏度、动态范围宽、多指标联检等优势，广泛应用于食品分析、环境分析和生物制药、科研等领域。近年来，随着我国对精准医学检验需求的提升及国内外专家的大力推广，液质联用技术越来越多的应用于临床检验领域。与此同时，为了使质谱技术更好的服务于临床实验室，仪器厂商们纷纷推出了各式各样的自动化样本处理系统，以解决质谱技术在临床检测过程中存在的自动化问题。
本文通过盘点市场上质谱前端自动化设备，结合质谱技术的特征，试图分析临床质谱自动化的现状并提出未来可能的发展方向。
一、临床实验室的工作流程
目前成熟的临床检验工作流程大致可以分为两类：一类为全自动分析工作流程，以较为成熟的如全自动化学发光仪、全自动生化分析仪等工作流程为例，包括检测试剂和待测样本的准备—条形码的识别—仪器自动分析—报告的自动生成，整个过程为流水线式作业，可以做到无人值守，对操作人员的要求较低。
另一类可归为半自动分析工作流程，以酶联免疫法、PCR分析法为例，需要取样、移液、洗涤等繁琐的过程，整个过程一般需要手动完成。若用自动化液体工作站代替手动操作即为半自动分析工作流程。半自动分析工作流程虽然可以替代人工完成部分操作，但每个操作步骤之间的连贯性差，集成度低，无法实现无人值守的流水线作业。与质谱检测法不同，尽管这类方法的样本处理过程自动化程度不尽人意，但样本一旦处理完成，酶标仪或PCR仪的检测的通量极高，酶标仪一般仅需数十秒、PCR仪则需要2小时即可完成96份样本的检测，且在数据生成和处理上无需人工干预。
二、临床质谱工作流程分析
如果将全自动化学发光仪的工作流程定义为自动化3.0，酶联免疫法的工作流程定义为自动化2.0，那么质谱检测的自动化工作流程还处在自动化1.0的水平。与全自动化学发光仪的工作流程相比，质谱检测的自动化之路主要有两个主要的制约因素。
全自动化学发光免疫分析仪
前处理设备与质谱仪集成度问题
样本在进入LC-MS系统前需要经过预处理，得到能与液相系统流动相互溶，且不含固体颗粒的液态样品。质谱法最常见的样本前处理方法，包括蛋白沉淀法、液液萃取法和固相萃取法等[1]。
蛋白沉淀法(PPT)样本前处理流程
液液萃取法(LLE)样本前处理流程
固相萃取法(SPE)样本前处理流程
根据以上3种样本前处理方法的流程图可知，质谱法的前处理过程较为繁琐，需要反复的移液，混合、离心等过程，涉及到涡旋混合器、离心机、氮吹仪等设备。近年来市场上推出了各式各样的自动化液体工作站，这些工作站将移液器、离心机、氮吹仪、正压固相萃取仪中的部分或全部功能都集成在封闭的空间内，从而实现流水线式的作业。
尽管这些设备解决了部分项目的样本处理问题，但无法与质谱仪高度融合，使之成为集样本处理、数据采集和分析于一体的全自动设备。其次，质谱项目处理流程过于复杂，经常存在“自由”变量，很难通过设定固定的程序对各种不同项目的样本进行处理。此外，耗材的成本也制约了该类设备的应用和推广。
自动化液体工作站
另一种自动化模式则与质谱仪的集成度较高，一般通过“二维液相”（也称之为多通道LC-MS，如Thermo的turboflow技术）与一台质谱仪串联实现[2]。该模式下液相色谱仪在分析柱前串接了净化柱（至少两套分析柱和两套样本净化柱），分别由洗脱泵（Eluting pump）和载液泵（Loading pump）提供液体流路。由于该系统一般采用类似在线固相萃取（online SPE）的方式处理样本，摒弃了蛋白沉淀法、液液萃取处理法等反复的移液过程，可直接吸取血清等样本用于分析，因而集成度更高。此外，该系统具有两套及以上的通道，采用多根色谱柱之间并联方式，可交错运行 LC-MS 分析程序，提高了质谱仪的利用率和样本的检测通量。该技术的不足同样很明显，SPE技术应用于多组分分析时，需要组分间的化学性质相似，这就极大的制约了该系统的应用场景。此外，血清或血浆样本若不经过预处理而直接进入净化柱（SPE柱），固然可以提高检测通量，但也导致了损耗的加快和使用成本的升高。
多通道LC-MS系统及原理示意图
液质联用技术的局限
与光谱分析法不同，质谱分析法检测的为物质的带电离子，物质首先需要在离子源内被电离，通过采样锥孔后进行离子聚焦、在质谱分析器中分离、最后被电子检测器识别并进行信号的处理。该过程中出现的变量导致了质谱仪并非稳定性强的仪器，可能会出现信号波动，特别是外界环境变化较大时。尽管物质离子在质谱仪中经历了一个相对“漫长”的过程，其检测通量却极高，每次扫描仅需数十毫秒，因此可以在一个色谱峰宽的时间内进行足够次数的扫描，完美的与液相色谱技术形成优势互补[3]。
液相色谱-串联质谱法的工作原理
令人遗憾的是，液相色谱（LC）分离的时间决定了其无法获得使人满意的检测通量，即使最快的超高液相色谱法，每次检测色谱分离也需要至少数分钟，从这个角度来说，液相技术又阻碍了质谱法的临床应用。其次，液相色谱技术存在过多的变量，如泵、流动相、色谱柱等等，特别是色谱柱，其产品本身性能、使用时间、串接方式等均会影响样本检测的结果，这也是导致临床质谱实验室对检测人员素质要求较高的原因。与LC相关的问题，如柱堵塞、携带污染、峰容量限制、高成本和逐渐的柱效损失，是临床质谱工作流程中出现数据质量问题或引起仪器故障的主要原因。这些挑战在大规模样品分析中变得更加明显，如大量临床样本检测通常需要LC系统在数十个小时持续的进样和分析，此时色谱柱的性能会从其原始状态持续降低，从而严重影响定量结果的一致性。即使用来自同一制造商的新色谱柱替换原有的色谱柱也可能无法完全解决这些问题。这些变量因素很难让液质联用仪成为化学发光仪这种自动化的检测设备，可以说，当下液质联用技术与临床检验所需的稳定性强、通量高、易操作等特点并不匹配[4]。
三、临床质谱自动化方向
灵活性和自动化的抉择
在实现全自动化质谱分析之前，需要做的是在质谱技术固有的开放、灵活与临床检测实验室所要求的“自动化和标准化”之间做出权衡[5]。在样本处理层面，当实验室样本量较大时，采用部分功能或功能齐全的液体工作站或是二维液相模式将取决于对检测通量、成本的预期。也可以通过将检测方法升级，使其更适用于自动化设备，如用磁珠法代替固相萃取法，用载体液液萃取法（SLE）代替传统液液萃取、用正压过滤来代替上清液移取等。
在LC-MS/MS系统检测层面，某些项目可通过简化或放弃液相色谱分离过程来提高系统的自动化程度，从而提高稳定性和检测通量。如安捷伦公司的RapidFire技术[6]，采用通过式的固相萃取技术，可实现每个样本20秒的检测通量。由于该系统不含常规色谱柱，因此无需考虑色谱柱带来的各种变量，十分适合对灵敏度无极致要求的项目，如维生素A、E的监测，治疗药物监测等。
RapidFire高通量液质联用系统
未来自动化模式的探讨
可以说临床样本与质谱仪之间的兼容性问题及液质联用技术本身的局限性塑造了当前临床质谱自动化现状，而后者则起着决定性作用。在相关技术尚未取得新突破前提下，通过优化样本处理流程，并将前处理过程中的各种设备及质谱仪集成在一台超功能仪器上或许是当下的最好选择。或许在不久的未来，在科研、制药等非临床领域质谱技术将继续保持其灵活独立的工作模式，使其能适用各种复杂的应用场景。而在医学检验领域，则衍生出集样本处理、数据采集、数据处理、报告打印为一体的全自动医用质谱仪。随着质谱技术的发展，也可能会出现新的分离技术(如离子淌度技术)[7]，这种效率更高、更稳定的的分离技术将取代色谱技术，届时制约质谱自动化的一些问题将会迎刃而解，从而实现真正意义上的全自动质谱分析仪。
参考文献
[1]. 中国医疗保健国际交流促进会基层检验技术标准化分会,中国医院协会临床检验专业委员会.液相色谱-串联质谱法临床样品前处理专家共识[J].中华预防医学杂志,2023,57(12):2073-2085..
[2]. Di Gaudio, Francesca, Annamaria Cucina, and Sergio Indelicato. "Turbulent Flow Chromatography: A Unique Two-Dimensional Liquid Chromatography." High Performance Liquid Chromatography-Recent Advances and Applications. IntechOpen, 2023.
[3]. Rankin-Turner, Stephanie, and Liam M. Heaney. "Mass spectrometry in the clinical laboratory. A short journey through the contribution to the scientific literature by CCLM." Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM) 61.5 (2023): 873-879.
[4]. Seger, Christoph, and Linda Salzmann. "After another decade: LC–MS/MS became routine in clinical diagnostics." Clinical biochemistry 82 (2020): 2-11.
[5]. 临床质谱走"集成式全自动化"之路？抑或"灵活独立化"之路？来源：媒体。
[6]. Jannetto, Paul J., and Loralie J. Langman. "High-throughput online solid-phase extraction tandem mass spectrometry: Is it right for your clinical laboratory?." Clinical Biochemistry 49.13-14 (2016): 1032-1034.
[7]. Jiang, Yuming, et al. "The Future of Proteomics is Up in the Air: Can Ion Mobility Replace Liquid Chromatography for High Throughput Proteomics?." Journal of Proteome Research (2024).
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