微生物鉴定是指借助现有的分类系统，通过对未知微生物的特征测定，对其进行细菌、酵母菌和霉菌大类的区分，或属、种及菌株水平确定的过程，它是药品微生物检验中的重要环节。菌种鉴定的常规手段包括形态学观察、生理生化特性鉴定和分子生物学鉴定等，而通过分子生物学的方法进行菌种鉴定不受生长培养基或分离物活性的影响，只需分离到纯菌落便可用于分析，更为直接和可靠。通过对细菌16S核糖体RNA(16S ribosomal RNA gene，16S rRNA)基因特征序列的测定，可实现细菌的生物学鉴定。
图1 核糖体16S rDNA[1]
核糖体RNA按沉降系数分为5S、16S和23S rRNA。16S rRNA为核糖体的RNA的一个亚基，16S rDNA就是编码该亚基的基因，存在于所有细菌的基因组中。16S rDNA是细菌的系统分类研究中最有用的和最常用的分子钟，由于大小适中，约1.5kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列。
1．使用商品化试剂盒提取细菌DNA，并用超微量紫外分光光度计检测DNA浓度。
2．选择16S rDNA保守区引物对细菌基因组上16S rDNA序列进行扩增，使用27F/1492R引物对扩增可获得包含V1-V9高变区的序列。
3．采用琼脂糖凝胶电泳法检测核酸扩增产物。在紫外凝胶成像仪上检视，核酸扩增产物应在约1500bp的位置出现一条目的条带。
图2 16S rDNA扩增产物1.5kb
4．根据琼脂糖凝胶电泳胶图选择切胶回收或者酶消化的方式纯化扩增产物，以去除扩增产物中的多余引物或非特异性扩增条带。
5．使用扩增引物作为测序引物分别进行测序PCR扩增。
6．通过磁珠法或商品化试剂盒对测序PCR扩增产物进行纯化，去除多余的染料。
7．使用3500XL基因分析仪对纯化后的测序PCR扩增产物进行电泳检测。
图3 27F/1492R引物测序结果
8．去除测序结果前后端部分序列后，使用NCBI等数据库进行比对，根据比对结果判断样本所属种属。
图4 NCBI数据库比对结果
[1]Molecular Approaches to Studying Microbial Communities: Targeting the 16S Ribosomal RNA Gene - Scientific Figure on ResearchGate. Available from: https://www.researchgate.net/figure/The-schema-of-ribosome-complex-and-16S-rRNA-gene-The-white-and-grey-boxes-indicate_fig2_308040658 [accessed 13 May, 2024]
[2]中国药典2020版四部通则1021 细菌DNA特征序列鉴定法
[3]中国药典2020版四部指导原则9204 微生物鉴定指导原则
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