在5月30日尚恩生物直播课程中，刘老师通过专业的讲解，让大家详细了解了悬浮细胞系通用培养指南相关内容。直播课件请点击尚恩公众号—回复关键词“直播课件”领取。
直播过程中不仅收获了大家的满满热情～也收到大家不少的提问，对于大家的疑问小尚这边都有认真整理，让刘老师做了详细解答，如果大家还有其他疑问的也可以在评论区留言哦！
1. 老师好，我养 THP1 细胞出现很多贴壁的情况，需要消化下来吗?
贴壁细胞不需要消化下来，可将悬浮细胞转移至新瓶中培养，舍弃贴壁的细胞。如果贴壁细胞特别多，需要检查培养基成分是否有误，血清质量是否不佳，培养器皿材质不适合，或者存在细胞交叉污染等异常情况。
2. 计数仪直径一般设置多少?
一般哺乳动物细胞直径在20um左右，需根据成像具体情况调整直径范围。
3. HL60 用什么冻存液，无血清冻存液会导致分化吗？
可以用92%完全培养基+8%DMSO、92%胎牛血清+8%DMSO、无血清非程序冻存液。HL60的分化主要和DMSO有关，和有无血清关系不大，冻存过程中一般不会刺激HL60分化，但复苏的时候需注意细胞融解后立即离心去除DMSO。
4. 老师我细胞总是复苏不起来什么原因？
复苏不起来原因很多，冻存前细胞状态不好，冻存密度过低，冻存条件不当，冻存和复苏过程中操作不当等等原因都可能导致复苏不起来，需要结合以上各方面排查原因。
5. 细胞背景里面总有黑点在动是污染了吗？
如果黑点大小形态不一，缓慢飘动，则是细胞碎片；如果黑点快速震动、原地打转或快速游动，则怀疑细菌污染。
6. 悬浮细胞正常形态是圆的吗？我的长的特别慢，高倍镜下还不圆。
有的悬浮细胞正常形态并不规则，可能呈椭圆形或多边形，可以结合ATCC等国际细胞库的照片来判断。若正常情况下应该是圆形的细胞变得不圆了，考虑细胞是否受到了较为剧烈的环境变化（运输震荡或更换了培养基配方、血清品牌）。细胞生长太慢，同时密度很低的情况下，需要离心并用更少的培养基重悬培养细胞，人为增加细胞密度来促进生长。另外，可多加血清促进细胞生长，注意血清最高比例不要超过20%。
7. 黑胶虫与细胞碎片怎么区别，有没有简单的判别方法
肉眼观察，细胞碎片大小不一，不会动或仅仅是缓慢飘动，少量细胞碎片对细胞状态没有影响。黑胶虫污染细胞一般有以下特点：1.污染前期无明显异常，随着培养可以明显发现细胞间隙有很多黑色颗粒甚至遮蔽细胞，并有可能伴随类似布朗运动的现象，培养基不会浑浊；2.细胞培养基消耗比较快，pH下降很快，需要经常换液；3.培养的细胞状态会变差甚至死亡；4.普通双抗对抑制黑胶虫无效。
8. 老师为什么我们培养瓶里的细胞会长的不均匀啊-边多一边少这个会有影响吗？
悬浮细胞培养一般都是均匀的，贴壁细胞生长不均匀可能是接种的时候没有摇匀或摇匀次数太多（具体原因可参考推文《百问百答 | 细胞贴壁不均匀是怎么回事？》。细胞生长不均匀对细胞影响不大，多养几天等细胞总体密度起来后重新消化接种即可，接种的时候注意十字法摇匀5-6次即可。
9. 血清多还是少了会容易聚团呢
细胞聚团和血清的量没有必然关系，通常和血清质量或品牌有关。
10. 瓶子可以重复利用吗？
悬浮细胞培养用的瓶子可以重复利用。但发现贴壁细胞增多要及时换瓶。
11. 悬浮细胞用不含有TC处理的培养瓶是不是更好？
理论上是的。但TC处理的培养瓶也可以养悬浮细胞，一般不会造成细胞异常贴壁。
12.培养基半天就发黄了，这正常吗，也是2-3天半换液一次吗？
排除污染的情况，细胞半天发黄也是正常的，细胞代谢过程中会产酸导致培养基ph降低而变黄。如果细胞量过多、细胞代谢活性强或培养基加的太少，都会导致培养基很快变黄。培养基变黄后要尽快换液，避免营养不足影响细胞状态。
13. 培养基变成紫红色是什么情况？
培养箱CO2供应异常，培养瓶不透气，都可能造成培养基变紫红色。排除这两个原因，则需要观察细胞状态，细胞密度低、状态不好、代谢活性低，培养基也会变紫红色。
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