2019年新冠病毒的确诊包含RT-PCR法、CT影像、基因测序等方法,其中RT-PCR核酸检测体系中所用引物与探针均为寡聚核苷酸(Oligo)。那么Oligo的研发生产过程中,其表征与纯化对于色谱柱的要求是怎样呢?
反相作为LC上分辨率较高且常使用的模式,而Oligo因为磷酸二酯链、核糖/脱氧核糖以及极性碱基的存在,使其在反相色谱柱上保留非常弱,故需在流动相中添加弱离子对试剂-烷基胺如TEA、DIEA。此外,也会添加HFIP改善峰形。
相比传统硅胶色谱柱,Phenomenex推出的杂化基质硅胶色谱柱Clarity Oligo-XT和Clarity Oligo-RP更耐受这样苛刻的溶剂环境,对Oligo也具有更佳的选择性。Oligo-XT采用了核壳技术,更大程度提高分辨率;Oligo-RP则采用全多孔杂化硅胶,可实现Oligo的高载样量,专为纯化而设计。
桥接寡核苷酸的分析示例
Column: Clarity 2.6μm Oligo-XT
Dimensions: 50X2.1mm
Mobile Phase:
A:50mM HFIP & 5mM DIEA in Water
B:50mM HFIP & 5mM DIEA in Acetonitrile
Flow Rate: 0.3mL/min
Gradient: 5-20%B in 15 min to 95%wash for 5 min
Temperature: 60°
Detection: UV/Vis 260 nm
Sample:Bridged Nucleic Acid 5'-TA/BNA-A/TA/BNA-meC/GT/BNA-T/TA/BNA-T/AC/BNA-G/CC/BNA-C/A-3'
寡核苷酸的纯化示例
Column: Clarity 3μm Oligo-Rp C18
Dimensions: 50X10mm
Mobile Phase:
A:50mM TEAA pH 7.5
B:Methanol
Flow Rate: 5mL/min
Gradient: 10-45%B in 30minutes
Detection:UV/Vis 260 nm
Sample:39mer & 40mer DNA
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