过去的几十年里,研究人员大多采用细胞群体进行生物学研究,但由于细胞之间存在异质性,基于细胞群体的研究已不能再满足科研的需求。
作为单细胞测序的一个重要里程碑,10X Genomics Chromium™实现了真正意义上的单个细胞测序。目前,10X Genomics单细胞转录组测序已广泛应用于肿瘤细胞异质性、免疫细胞群体检测以及胚胎发育等研究。
今天就为大家介绍下10X Genomics单细胞转录组测序。
技术原理
10X Genomics的Chromium系统利用8通道的微流体“双十字”交叉系统,将含barcode的凝胶珠(Gel Beads)、细胞和酶的混合物、油三者混合,形成GEMs(油包水的微体系)。GEMs形成后,细胞裂解,凝胶珠自动溶解释放大量barcode序列,随后mRNA逆转录产生带有10X barcode和UMI信息的cDNA,构建标准测序文库,其中10X barcode用于区分细胞,UMI用于区分mRNA分子。
建库流程
(1)凝胶珠进入第一个进样口与细胞悬液和酶等混合,通过第二个进样口时被油滴包裹,形成GEMs,随后细胞裂解,凝胶珠溶解,进行逆转录;
(2)油滴破裂,收集cDNA产物,进行cDNA扩增;
(3)构建测序文库进行测序。
样本准备
欧易提供携带10X Genomics上门建库服务,由于10X Genomics对样本要求较高,老师需注意以下几点样本要求:
(1)细胞数量:一个样品细胞起始量大于1x105个;
(2)细胞浓度:5x105-1.2x106 /ml,最低需要1x105ml;
(3)细胞活性:活细胞数量在90%以上;
(4)细胞大小:直径小于40 μm;
(5)细胞培养基及缓冲液不能含有Ca 2+和Mg 2+等影响酶活性的物质;
(6)组织需解离成单细胞悬液,植物细胞需制成原生质体。
常见问题
为什么每个样品需要那么多的细胞量?
答:细胞在上机之前,需要对进行一系列的质检,质检过程需要使用部分细胞。
为什么对细胞活性有要求?
答:死细胞中的降解的RNA片段会混进GEMs中,影响测序结果。
如何检测细胞活性?
答:可以使用台盼蓝染色,用显微镜观察计数。
为什么对细胞大小有要求?
答:由于凝胶珠和油滴的大小是一定的,细胞过大会影响油包水微体系的结合。
为什么细胞培养基及缓冲液不能含有Ca 2+和Mg 2+等影响酶活性的物质?
答:Ca 2+和Mg 2+等会影响酶活性从而影响到cDNA的生成。
10X genomics单细胞转录组测序需要测多少数据量?
答:根据10X genomics官方的Single Cell 3' v2试剂盒,最低每个细胞测50K reads。