质谱成像可用于研究化合物在生物样本中的分布情况。由于解析电喷雾电离(DESI)相比较传统的基质辅助电离(MALDI)在样品前处理操作方面更简单,因而被越来越广泛地应用于质谱成像研究领域。
当DESI质谱成像技术遇到离子淌度质谱(HDMS),实验操作可同时具备高灵敏度和高分辨率的优势,利用碰撞横截面积(CCS)测量增加化合物的鉴定可信度。同时,检测峰容量也可得到有效提高。
以下实验向大家展示了从DESI HDMS成像实验中获取化合物CCS值的流程。从中可以看出沃特世离子淌度质谱在CCS值测量过程中的优秀表现—— 标准品所测CCS值及大鼠脑组织内源性化合物所测CCS值与文献经验值之间的误差小于2%。
样品准备
沃特世校正液
亮氨酸-脑啡肽 lock mass (P/N 186006013);Major Mix离子淌度/Tof CCS校正液(P/N 186008113)。
CCS标准品
咖啡因,磺胺胍,Val-Tyr-Val,戊脉安,丁本哌丁醇,利血平(Sigma Aldrich), 原溶液溶于甲醇或甲醇/水 80/20 (v/v),浓度为1 mg/mL;用甲醇稀释到5-50 ng/μL;将1 μL标准品稀释液滴于Prosolia 25孔样品板待测。
用于质谱成像的组织样本
15 μm厚度的大鼠脑冰冻切面,置于载玻片。
方法
离子淌度质谱成像系统:质谱采用SYNAPT G2-Si Ion Mobility QTof,离子源采用沃特世DESI。喷雾溶剂MeOH/H2O 95/5 (v/v)+0.1% FA,流速3 μL/min,雾化器N2压力4.5 bar,喷雾电压2.5 kV,质谱采集使用正离子模式,扫描范围m/z 50-1200, 空间分辨率100 μm。质谱成像数据采集使用MassLynx 4.2系统,数据处理使用高清成像软件(HDI),CCS值由Excel计算得出。
下面,我们先了解一下DESI HDMS基本结构与原理(请在以下方框中往下滑动查看)。
离子淌度质谱成像
用于质谱成像的离子淌度质谱装置如图1所示:
图1. DESI SYNAPT G2-Si QTof离子淌度质谱仪
质谱成像基本概念:
图2. 质谱成像操作图解
解析电喷雾电离源
● 喷雾溶剂在高电压作用下经氮气辅助形成带电喷雾液滴;
● 束状带电喷雾轰击样品表面,与待分析物发生解吸与电荷转移;
● 解吸附的分析物经毛细管导入至质谱进行后续检测分析。
图3.电喷雾解吸电离源
离子淌度质谱
离子淌度是基于离子的结构大小与三维构象进行分离的技术,是质谱分离方法的补充。SYNAPT使用的行波离子淌度质谱技术是利用直流脉冲使一系列离子通过中性氮气流以行波方式前进,分子结构越大越不容易通过氮气气流。
图4.行波离子淌度质谱分离技术
碰撞横截面积(CCS)
离子淌度漂移时间与离子翻转滚动时的平均碰撞横截面积(即CCS值)相关。CCS值是离子的固有物化属性,其大小取决于离子的化学结构(质量、大小)和三维构象(形状)。
图5. 离子淌度质谱测量的平均翻转碰撞横截面
实验流程
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测量化合物的离子淌度漂移时间
图6. 由DESI HDMS成像数据得到精确质量数与离子淌度漂移时间的工作流程
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计算CCS值
通过所测得的离子淌度漂移时间和精确质量数计算CCS值
图7. 由Excel计算CCS值流程
实验结果
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DESI HDMS成像实验中的标准品CCS值的计算
图8展示了CCS标准品的DESI HDMS成像结果,根据上述流程得出对应CCS值,与理论值的误差范围在2%以内。
图8.DESI HDMS成像所得标准品CCS测量值
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离子淌度技术对同分异构体的分离
对于m/z相差小于4 ppm的异构体,质谱分辨率需达到870,000才能得到较好的分离。由于这些异构体离子对具有不同CCS值,即形状结构具有差异,因此通过离子淌度质谱即可对这些异构体进行有效分离。
图9.离子淌度质谱对具有不同CCS值的异构体的分离
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对于大鼠脑组织的DESI HDMS成像实验中
内源性化合物CCS值的计算
通过DESI HDMS可在大鼠脑组织中检测到大量内源性脂质以及小分子代谢物。下图给出了一系列具有代表性的化合物成像图。这些内源性化合物计算所得的CCS测量值与文献值(Metlin和LipidMAPS)误差范围在2%以内。
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未知峰的识别与鉴定
质谱成像中的未知峰鉴定:从HDI导出精准质量数与在线数据库进行匹配,质荷比差异控制在±10 mDa范围内,可以对未知峰进行有效鉴定。
结论
● 根据简化的工作流程可从DESI HDMS成像数据中计算化合物CCS值。
● 离子的CCS值可根据其离子淌度漂移时间、精准质量数以及CCS校正参数在Excel内计算得出。
● 实验结果显示标准品以及大鼠大脑内源性化合物的CCS测量值与文献值误差在2%以内。
● 通过该方法可得到大量脂质以及内源性化合物的CCS值,其中包括没有参考CCS值的化合物,用此方法可以丰富内源性化合物CCS数据库。