认识细胞内的分子结构、定位以及相互作用是深入理解细胞功能、生命活动的重要条件，经过几十年的发展，共聚焦显微镜已经成为研究这一块的最重要的手段之一。
但是由于衍射极限的存在，常规光学显微镜分辨率只有200-300nm，而细胞内的亚细胞器、蛋白结构等尺寸往往远小于这个值，突破衍射极限得到高分辨率甚至超高分辨率图像就变得尤为重要了。
徕卡一直以来致力于高端显微成像技术的开发和创新，为科研工作者提供最优方案，针对不同的研究需求相继推出了超高分辨率的STED（分辨率达30nm）和高分辨率的HyVolution（130nm）。下面我们简单看看HyVolution的特点以及其在科学家们的科研工作中发挥着怎样的作用。
HyVolution—从共聚焦到高分辨率就是这么简单
Leica SP8 HyVolution——直接建立在Leica SP8共聚焦平台上，以高灵敏HyD检测器及Huygens为基础，能够提供高达130nm的高分辨率，并且将轴向分辨率提高一倍，让我们瞬间从共聚焦到高分辨率！
Paramecium tetraurelia, two color confocal versus HyVolution Super-Resolution image . Green: Basal bodies, red: Epiplasmin (AF568). Sample courtesy of Anne Aubusson-Fleury, CNRS, Gif sur Yvette, France
生命是动态的，因此我们除了要看得清还需要能捕捉这个动态过程，HyVolution在得到高分辨率的同时丝毫不会影响图像采集的速度，完全支持 SP8（40 fps @ 512-512 像素）的全帧速率。因此能够采集毫秒内发生的变化，并以高清晰度观察细胞动态的超微细节，满足我们的研究需要。
HeLa Kyoto cells. Golgi-GFP(green), GPI-YFP (yellow), H2B-mCherry (white). Sample courtesy of Sabine Reither, EMBL Heidelberg, Germany.
此外， HyVolution可以进行高达5个通道的同时成像，能够为多色荧光标记的活细胞提供真正的实时同步多色成像，确保采集到多种蛋白相互作用的高分辨快速动态过程。
COS-7 cells, BodipyFL Phallacidin (Actin), Alexa Fluor 568 F(ab'')2 (Tubulin), Alexa Fluor 647 F(ab'')2 (Mitochondria), DAPI (nuclei). Sample courtesy of Dr. Jana Doehner, Center for Microscopy and Image Analysis, University of Zürich, Switzerland
总的来看，HyVolution在分辨率、速度和多色上都有非常优异的表现，可以为我们研究活细胞快速动态变化、多色荧光同时成像，获得细胞内各种细节信息提供一大助力。
HyVolution助力解析细胞内调节机制
代谢通路如何促进乳腺癌转移：发表于JCB上的题为《P53 - and mevalonate pathway-driven malignancies require Arf6 for metastasis and drug resistance》的研究报告表明，在特定乳腺癌中被上调的代谢通路——MVP(mevalonate pathway)，可通过激活细胞信号蛋白Arf6来促进乳腺癌的转移。
甲羟戊酸途径（MVP）是一种特殊的代谢通路，与肿瘤转移密切相关，长久以来都是肿瘤研究的热点，但是其作用机理还未知。
研究者推测，MVP途径或可通过激活Arf6信号通路来促进癌细胞的侵袭性，进而增强癌细胞的转移和侵袭力。而Arf6蛋白只有到质膜上才能被激活。Arf6蛋白是无法仅靠自己进行胞内运输到达质膜的，那么它的助手是谁？通过一系列实验初步确定为Rab11a和Rab11b。那么到底是哪一个呢？
HyVolution清楚解析到Rab11a/Rab11b和Arf6的位置关系，根据共定位关系可以一目了然推测出Rab11b在Arf6运输中的作用更为显著，进而得到整个调节路径：MVP通路通过产生特殊的脂质基团将蛋白Rab11b锚定到细胞膜上，从而促进Rab11b将Arf6蛋白运输到质膜，完成Arf6蛋白向质膜的募集，而在质膜中Arf6就会被受体酪氨酸激酶所激活。
研究报告提到阻断MVP通路或可有效杀灭过表达Arf6蛋白的癌细胞，MVP通路的解析使开发对应的治疗方法有了更为明确的目标。
HyVolution找到GapmeR进入T淋巴细胞途径
发表于《Scientific Reports》的题为《GapmeR cellular internalization by macropinocytosis induces sequence-specific gene silencing in human primary T-cells》研究报告深入探究了GapmeR进入T淋巴细胞的途径。
T淋巴细胞是适应性免疫中的主要效应细胞，为了更好地理解其在慢性炎症、自身免疫、淋巴癌中所起的作用，转录后基因沉默这一技术受到越来越多的关注。而siRNA和CRISPR-Cas9由于T淋巴细胞低的转染效率而效果并不显著。
GapmeR——作为一种新兴的分子可以通过转录后基因沉默特异性敲除感兴趣靶基因。GapmeR进入细胞会与内源mRNA结合形成GapmeR-mRNA复合物，被RNase H识别从而降解目的mRNA进而特异性抑制靶基因的表达。借助丰富的基因序列数据库和生物信息学工具来设计GapmeR使其对目的mRNA具有极高的亲和性，同时具有良好的药代动力学和组织渗透性等特性。
那么GapmeR是如何进入T淋巴细胞从而发挥作用的呢？
利用共聚焦以及HyVolution等高分辨率成像技术，可以发现GapmeR内化效率极高，进入细胞的GapmeR分布于整个胞浆和细胞核中，细胞内的GapmeR分子为甜甜圈状的囊泡结构，GapmeR与SNX5共定位而与Rab5和Caveolin1不共定位，胞吞途径抑制剂会阻碍GapmeR的内化。可以知道GapmeR进入T淋巴细胞的过程：GapmeR和细胞内的SNX5（sorting nexin family of proteins）-囊泡作用，通过类似胞饮的内吞进入T淋巴细胞，无需转染试剂也不用电穿孔。
此种方法不会影响细胞正常活性，操作简单，基因沉默效率高，在基础研究和免疫治疗上都会有重大作用。
FAM-GapmeR (green) , phalloidin (cyan) , Hoechst (blue)
FAM-GapmeR (green) ,anti-SNX5/Alexa Fluor® 568 (red) and Phalloidin-Alexa Fluor® 647 (light blue)
参考文献
1. Hashimoto, A., et al. (2016). "P53- and mevalonate pathway-driven malignancies require Arf6 for metastasis and drug resistance." J Cell Biol 213(1): 81-95.
2. Fazil, M. H., et al. (2016). "GapmeR cellular internalization by macropinocytosis induces sequence-specific gene silencing in human primary T-cells." Sci Rep 6: 37721.
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