01介绍
人胚胎肾细胞（HEK293）有着稳定生长，高转染效率以及能够表达高滴度病毒的优势，所以广泛用于表达重组病毒和重组蛋白。腺病毒载体是开发治疗性疫苗，对抗感染性疾病疫苗以及细胞治疗药物中最常用的病毒载体之一。
实验结果表明：与对照培养基 B 相比，在摇瓶和反应器两种规模下使用 CDM4HEK293 培养基进行 HEK293 细胞培养和腺病毒包装，效果更好。
02
材料与方法
1
细胞驯化
将 HEK293.2sus 细胞株（ATCC）逐步驯化至 HyCloneCDM4HEK293（A）和对照培养基（B）两种不同的培养基中。细胞驯化过程是将培养基 B 中的细胞以 5×10E5 密度接种至 CDM4HEK293 培养基中后连续培养。以 100%/0%、50%/50%、25%/75%、12.5%/87.5%、0%/100% 的比例梯度进行连续驯化。细胞每 3~4 天或者 2 次倍增后传代。驯化过程中每个培养基比例下培养 2~3 代，最终将培养基 B 比例降至 0%（最终细胞活率大于 90%）。
2
摇瓶培养
HEK293 细胞以 4 × 10E5 cells/mL 接种 30~50 mL 的 CDM4HEK293 或者培养基 B 中，摇瓶规格为 125 mL，培养基添加 4 mM 的 L-glutamine。摇床的设置参数为 100 rpm、37 ℃、5% CO2，当细胞密度和活率下降时终止培养，培养过程中每个实验组分 3 瓶。
3
病毒增殖
以 E1/E3 基因缺失的 Adv5 病毒感染细胞，该病毒编码了绿色荧光蛋白（GFP）。在预定的时间内以感染复数（MOI）1 或 10 感染细胞，细胞密度为 1 × 10E6 cells/ mL。病毒需要经过三次反复冻融后进行收获，收获时间（TOH）在感染后 42 至 48 小时。
4
病毒滴度
在 96 孔板中培养贴壁的 HEK293 细胞，收获病毒裂解物，进行 10 倍连续倍比稀释感染。感染后孵育 48 小时，表达 GFP 的感染细胞使用自动荧光显微镜 IN Cell Analyzer 2200 检测。
5
反应器培养
在生物反应器中将 HEK293.2sus 细胞以细胞密度接种将 2.5 × 10E5 cells/mL 加入 1 L 体积 CDM4HEK293 培养基中。接着将细胞接种到一次性 XDR 10 L 细胞培养袋中，最终的生物反应器培养体积为 8L。细胞在 XDR-10 生物反应器中设置的培养参数如表 1。
6
培养分析
在培养期间对培养物进行取样并分析细胞生长、活率、形态、细胞代谢、营养消耗和渗透压。细胞生长和活率使用 Vi-CELL 分析仪测定（贝克曼库尔特）。葡萄糖（GLC）、乳酸（LAC）、氨（NH3）、谷氨酰胺（GLN）和谷氨酸（GLU）使用 CEDEX™ Bio 分析仪（罗氏）。在摇瓶培养阶段的 细胞形态用显微镜观察。反应器培养阶段的渗透压使用 Bioprofile FLEX™ 分析（NovaBiomedical Corp.）。
03
实验结果
1
摇瓶培养
HEK293 细胞在 CDM4HEK293 中或在对照培养基 B 中培养两周，直至活力下降后终止。期间每天取样检测细胞密度和活率（见图 1）。在 CDM4HEK293 培养基中，细胞生长良好密度超过 5.5 × 10E6 cells/mL，而在对照培养基中，细胞计数约为 3.5 × 10E6 cells/mL。
图 1 Cell growth and viability in (A) CDM4HEK293 medium and (B) reference medium for triplicate shake flask batch cultures
每天或每隔一天进行取样检测细胞营养消耗和代谢情况（见图 2）。最初的 CDM4HEK293 培养体系中葡萄糖浓度接近 7 g/L，之后随着生长阶段中葡萄糖的消耗，细胞活率逐渐降低。谷氨酰胺随着氨浓度的增加而快速减少。CDM4HEK293 培养物体系中的谷氨酸浓度略有增加，而乳酸水平在 2 种培养基中基本相似。使用显微镜观察细胞形态和聚集情况，图 3 是接种后 24、96 小时的照片。
图 2 Nutrient and metabolite concentrations in (A) CDM4HEK293 medium and (B) reference medium in triplicate shake flask batch cultures
图 3 Cell morphology at 24 h and 96 h after inoculation in the (A,B) CDM4HEK293 medium and (C,D) reference medium in shake flask batch cultures
AdV5-GFP 在 CDM4HEK293 中感染滴度高于 B 培养基（见图 4）。
图 4 Infectious virus productivity in shake flask cultures using CDM4HEK293 or reference cell culture medium
2
生物反应器培养
为了证明细胞在 CDM4HEK293 中的可放大性，所以使用 XDR-10 生物反应器培养 HEK293 细胞。将细胞在 8 L 工作体积中培养直到细胞生长和活力开始下降。细胞峰值密度约为 5 × 10E6 cells/mL，活率为 95%（见图 5）。结果与摇瓶培养相似。
图 5 Cell growth and viability in 8L CDM4HEK293 bioreactor culture
生物反应器中的营养消耗和代谢物浓度（见图 6）与摇瓶培养营养代谢曲线（见图 2A）相似。当营养物被消耗时，代谢物积累。在培养第 8 天后细胞达到峰值密度，营养浓度降低，代谢产物浓度大幅升高。反应器中 pH 设定值为 7.1，培养过程中对 pH 进行监测，结果显示 pH 可以稳定在设定值。培养期间渗透压稳定在 300~325 mOsm/kg 之间（渗透压基线浓度为 307 mOsm/kg）。
图 6 Nutrient and metabolite concentrations in 8L CDM4HEK293 bioreactor culture
04结论
我们在摇瓶中分别使用 CDM4HEK293 和对照培养基两种不同的培养基进行 HEK293 细胞的培养和腺病毒包装，结果显示：与对照培养基相比，HEK293 细胞在 CDM4HEK293 培养基中生长和进行腺病毒包装，效果更佳。
为了证明 HEK293 细胞在 CDM4HEK293 中的可放大性，使用 XDR-10 生物反应器培养 HEK293 细胞，并与摇瓶培养进行对比，两种培养系统培养效果基本一致。
订购信息：
参考文章：
[1] Kallel, H. and Kamen, A. A. Large-scale adenovirus and poxvirus-vectored vaccine manufacturing to enable clinical trials. Biotechnol. J. 10, 741-747 (2015).
[2] Appaiahgari, M. B. and Vrati, S. Adenoviruses as gene/vaccine delivery vectors: promises and pitfalls. Expert Opin Biol Ther. 15, 337-351 (2015).
[3] Evaluation of HEK293 cell growth and adenovirus productivity in HyCloneTM CDM4HEK293 medium. Application note, 29264715 AA.
首页
