● 期刊：J Allcrgy Clin Immunol
● 发表时间：2021.03
● 影响因子：10.228
中性粒细胞毛囊炎是毛囊的炎症状态。在一些中性粒细胞毛囊炎中，如痤疮和化脓性汗腺炎患者，也观察到毛囊角化过度。嗜中性粒细胞毛囊炎通常由高脂肪饮食诱发和/或加重(HFD)。然而，HFD病影响中性粒细胞毛囊炎的分子机制尚未完全了解。
HFD: High-fat diet/高脂肪饮食；
ND: Normal diet/正常饮食；
PKC: Protein kinase C/蛋白激酶C；
PMA: Phorbol 12–myristate 13–acetate/ PKC激活剂
正常饮食小鼠 vs 高脂饮食小鼠
转录组检测，空间代谢组，组织学
1
HFD引起毛囊角化过度
为了研究HFD对毛囊结构的影响，用HFD或ND喂养小鼠8周，与用ND喂养的小鼠相比，用HFD喂养的小鼠体重增加。组织学分析表明，在HFD喂养的小鼠中，大多数毛囊被角质细胞堵塞(下图)，如在痤疮的早期所见。然而，在HFD喂养的小鼠的毛囊周围没有观察到炎性细胞浸润。这些结果表明，单独摄入HFD可导致毛囊角化过度，而不会诱发毛囊炎症。
2
HFD上调与上毛囊角质细胞分化相关的基因
接下来，研究了HFD如何影响整个皮肤基因表达谱。在给小鼠喂食HFD或ND后8周，对耳朵皮肤进行核RNA-seq分析。观察到在HFD喂养的小鼠皮肤中有473个基因被显著上调，246个基因被显著下调(图B)。在HFD喂养的小鼠中上调超过4倍的51个基因中，观察到与角质化相关的基因，包括Krt16、Klk、Sprr和Flg。基因本体分析揭示了上调基因与角质细胞分化的关联，如角化包膜的形成和皮肤屏障的建立(图C)。
表皮角质形成细胞分为泡间角质形成细胞和滤泡角质形成细胞。耳间角质形成细胞进一步分为4组，即基底层角质形成细胞、鳞状层角质形成细胞、颗粒层角质形成细胞和角质形成细胞。毛囊角质形成细胞根据位置分为3组，即上毛囊、外隆突和内隆突。为了研究哪组角质形成细胞受HFD效应影响最大，比较了每组角质形成细胞中特异性表达的基因表达水平的变化。发现，在HFD饲养的小鼠中，主要表达于上毛囊的基因，包括Krt79和Krt17，显著增加(图D和E)。因为已知这些基因调节角质形成细胞的分化，我结果表明HFD影响角质形成细胞的分化，尤其是在上毛囊中。
3
PMA化学刺激后，HFD促进毛囊炎
在中性粒细胞毛囊炎中，中性粒细胞的积聚发生在毛囊内和毛囊周围的细胞(如毛囊角质形成细胞)产生炎症分子之后。因此，假设HFD可能在外部刺激后促进毛囊角质形成细胞产生趋化因子，从而诱导毛囊周围的中性粒细胞浸润。
为了验证这一假设，应用PMA刺激HFD喂养小鼠的皮肤，是一种蛋白激酶C (PKC)激活剂，经常用作化学物质来激活各种细胞类型，包括角质细胞。接下来，评估了毛囊周围的中性粒细胞浸润和皮肤中趋化因子的表达水平。用PMA (10ng/mL)不会在ND-HFD小鼠皮肤中引起显著的组织学变化。然而，在HFD喂养的小鼠皮肤上施用后24小时观察到表皮脓肿(图A)。炎症细胞主要由Gr-1+细胞组成(图B)。
表皮细胞的流式细胞分析显示，在HFD喂养的小鼠的表皮中，Ly6G+ CD11b+中性粒细胞显著增加(图C)。在HFD喂养的小鼠的表皮中，Ly6G-Ly6C+CD11b+单核细胞也有所增加，但是单核细胞的绝对计数远小于中性粒细胞的绝对计数。在PMA应用前后，在ND-和HFD喂养的小鼠之间的表皮中分析的其他免疫细胞(例如，朗格汉斯细胞和树突表皮T细胞)中没有观察到显著差异。在喂食另一种具有不同脂肪酸组成的HFD的小鼠中，也观察到中性粒细胞和毛囊炎的浸润增加。
这些结果支持了假设，即至少在PMA的刺激下，HFD促进了毛囊周围中性粒细胞的浸润。另一方面，在另一种刺激物(十二烷基硫酸钠)的化学刺激下，尽管HFD喂养的小鼠表现出耳肿胀反应和皮肤中性粒细胞浸润增加，但在该模型中未观察到毛囊炎。这些结果表明在HFD喂养下中性粒细胞毛囊炎的发展取决于刺激物的类型。
4
HFD诱导炎症反应和白细胞迁移相关基因的表达
为了了解HFD对PMA引起的皮肤炎症的影响，进行了PMA应用后皮肤的RNA-seq基因表达谱分析。总之，1318和1486个基因分别被PMA在ND和HFD喂养的小鼠中提升(图A)。在HFD喂养的小鼠中有1486个基因被提升，其中897个在ND小鼠中也被提升，589个仅在HFD喂养的小鼠中被提升。基因本体分析显示，两组中普遍升高的基因主要与细胞周期有关(图B)，已知这是由PMA诱导的。然而，仅在HFD喂养的小鼠中升高的基因与炎症反应和白细胞迁移有关。在升高的各种促炎细胞因子中，包括嗜中性粒细胞吸引趋化因子(如Cxcl1和Cxcl2、S100a8和S100a9)(图C)。与这一结果一致，据报道，这些基因的表达在人中性粒细胞毛囊炎，如痤疮和化脓性汗腺炎中升高。
为了比较这种小鼠模型和人类中性粒细胞毛囊炎模型的基因表达谱，使用人类寻常痤疮和化脓性汗腺炎基因表达谱的公共数据集。根据以前报道的方法进行小鼠和人之间基因表达谱的比较。作为比较，使用非神经性炎症性皮肤病的数据，如接触性皮炎、特应性皮炎和寻常型银屑病。选择以前用于区分炎症性皮肤病基因表达谱的基因。还选择了在PMA试验后喂食HFD的小鼠中表达水平升高的基因。发现HFD/PMA诱导的毛囊炎小鼠皮肤中的基因表达模式与化脓性汗腺炎和痤疮小鼠皮肤中的基因表达模式相似，随后是接触性皮炎、特应性皮炎和寻常型银屑病(图D和E)。这些结果表明，HFD增强PMA诱导的皮肤炎症，并诱导与中性粒细胞毛囊炎相关的基因表达谱的几个独特的特征。
5
PMA刺激后HFD上调毛囊角质形成细胞CXCL1的表达
在这个HFD/PMA诱导的毛囊炎模型中，诱导了中性粒细胞和吸引中性粒细胞的趋化因子。因此，检查这些趋化因子是否直接参与皮肤的中性粒细胞浸润。正如组织学和流式细胞分析(图A和B)所证实的，在CXCR2缺陷(Cxcr 2-/-)小鼠中，中性粒细胞的浸润几乎完全消除，这表明CXCL 1/CXCL 2-CXCR 2信号对于HFD/PMA诱导的毛囊炎模型中皮肤中的中性粒细胞浸润是必需的。因此，随后定量研究了HFD小鼠皮肤中CXCR2配体CXCL1和CXCL2的表达水平和来源。
用定量逆转录聚合酶链反应检测了ND和HFD小鼠表皮Cxcl1和Cxcl2的表达水平。在PMA给药后3小时，ND和HFD喂养的小鼠的Cxcl1表达水平都增加了，并且在用HFD小鼠中显著高于ND小鼠(图C)。Cxcl2表达水平在PMA给药后3小时也上调，但在ND喂养的小鼠和HFD喂养的小鼠之间相当(图D)。这些结果表明，CXCL1而不是CXCL2的增加参与了HFD喂养小鼠毛囊炎的形成。
然后检查表皮CXCL1表达的来源。我们通过流式细胞术对表皮细胞亚群(Sca-1-毛囊角质形成细胞、Sca-1+耳间角质形成细胞、朗格汉斯细胞和树突状表皮T细胞)进行了分类，并在应用PMA后3小时检测了Cxcl1基因的表达。Cxcl1在角质形成细胞中的表达较高，并且在ND和HFD的小鼠中，毛囊角质形成细胞中的表达水平显著高于耳间角质形成细胞中的表达水平(图E)。原位杂交分析证实了Cxcl1在毛囊细胞中的表达，主要在皮脂腺上方的毛囊上部(图F)。
总的来说，这些结果表明HFD通过从上毛囊的角质形成细胞产生CXCL1来促进PMA诱导的表皮中性粒细胞浸润。
6
高脂肪饮食使皮肤在形成肥胖表型之前易患中性粒细胞毛囊炎
注意到与正常饮食喂养的小鼠相比，喂食高脂肪饮食8周的小鼠体重增加。因此，可能是体重，而不是高脂肪饮食，导致了PMA刺激后高脂肪饮食喂养的小鼠的表型。为了分析体重和高脂肪饮食对毛囊炎发展的影响，我们用正常饮食或高脂肪饮食喂养小鼠1-2周，在此期间两组小鼠的体重没有差异(图A)。此外，在第2周，两组间内脏脂肪中促炎细胞因子如白介素-6、肿瘤坏死因子-a和白介素-1b的基因表达水平无显著差异。这两组小鼠接受了PMA皮肤刺激。浸润表皮的中性粒细胞数量增加，喂食高脂肪食物两周的小鼠出现明显的毛囊炎(图B-D)。这些结果表明，无论体重是否增加，高脂肪饮食都会使皮肤易患中性粒细胞毛囊炎。
然后评估HFD效应是否可逆。为此，在最初的2周给小鼠喂食HFD，然后在接下来的2周换成ND(HFD-ND组)，随后用PMA进行治疗。作为对照，我们准备了一个ND-ND组和一个ND-HFD组，在ND-ND组中，ND连续给药4周，在ND-HFD组中，ND在前2周给药，然后在接下来的2周换成HFD。在应用PMA时，这些组的体重没有差异(图E)。在ND-HFD组中，观察到明显的毛囊炎以及中性粒细胞和单核细胞浸润(图F-H)。相反，在HFD-ND组中，未观察到毛囊炎，中性粒细胞和单核细胞对皮肤的浸润与ND-ND组相似。这些结果表明HFD对皮肤的影响是可逆的。
7
HFD改变皮肤中脂肪酸的含量
因为丰富的脂肪酸是HFD的特征，从增加脂肪酸摄入的角度研究了HFD引起的毛囊角质化和HFD/PMA引起的毛囊炎的机制。首先，研究了摄入HFD后皮肤中脂肪酸含量的变化。HFD喂养2周后，皮肤中的脂肪酸总量显著增加(图A)。这种增加可能是由于皮肤中积累的增加，而不是脂肪酸合成的增加，因为通过RNA-seq对乙酰辅酶a代谢过程进行的基因集富集分析表明，在ND和HFD的小鼠之间，脂肪酸合成的基因集没有差异(图B)。此外，发现ND-和HFD-喂养的小鼠皮肤中脂肪酸受体和转运蛋白的基因表达水平没有差异。此外，HFD喂养2周后，ND-和HFD-喂养小鼠的血清脂肪酸水平几乎相同。
然后，通过成像质谱检查了皮肤中脂肪酸的组成，重点是HFD中包含的主要脂肪酸。在ND小鼠的皮肤中，不饱和脂肪酸如棕榈油酸和油酸大量积累，而饱和脂肪酸如棕榈酸、硬脂酸和肉豆蔻酸含量很低。除了硬脂酸的含量外，在HFD喂养的小鼠皮肤中，所研究的脂肪酸的含量比在ND小鼠皮肤中显著增加。
8
局部应用脂肪酸促进毛囊角化过度和PMA诱导的毛囊周围中性粒细胞积聚
最后，研究了在高脂肪饮食喂养的小鼠皮肤中应用升高的脂肪酸是否会导致正常饮食喂养的小鼠的皮肤发生与高脂肪饮食喂养的小鼠的皮肤相似的变化。为了检验这一点，将棕榈油酸、油酸、肉豆蔻酸和棕榈酸连续5天涂在正常饮食喂养的小鼠的耳朵皮肤上，然后将PMA涂在皮肤上。每种脂肪酸的应用诱导表皮增生，其程度在棕榈酸处理的皮肤中最高。软脂酸处理皮肤的组织学也观察到毛囊角化过度(图A)。
一致地，每种脂肪酸的应用诱导角质化标记物如Krt16和Klk6以及毛囊角质化标记物如Krt17和Krt79的升高。这些变化的程度在用棕榈酸处理的皮肤中最高(图A和B)。施用PMA后，在用上述每种脂肪酸处理的皮肤中的毛囊周围观察到表皮脓肿(图C)。
流式细胞分析显示，与载体处理后相比，用每种脂肪酸处理的小鼠表皮中的中性粒细胞数量增加(图D和E)。此外，用棕榈酸处理的小鼠比用其他脂肪酸处理的小鼠毛囊周围的中性粒细胞积聚更明显(图C-E)。Cxcl1和S100a9的表达在用某些脂肪酸，特别是肉豆蔻酸和棕榈酸处理的小鼠原代角质形成细胞中增加，尽管在体外没有观察到脂肪酸处理后Krt16的增加。
总的来说，这些结果表明摄入HFD改变了皮肤中脂肪酸的含量，这可能在PMA引起的毛囊角化过度和中性粒细胞毛囊炎中起作用。
总之，本文证明了一种由HFD诱发的皮肤新表型，特别是在PMA作为刺激物的刺激下。结果强调了膳食脂肪酸作为促进伴有滤泡表皮角化过度的中性粒细胞毛囊炎发展的关键因素的重要性。对这种机制联系的进一步阐明可能为开发治疗慢性中性粒细胞毛囊炎(如痤疮和化脓性汗腺炎)的新方法铺平道路。
Q:
为什么要做脂质组学研究？
A:
“脂质组学”实际上是“代谢组学”的一个分支。但是，由于脂类代谢 (如血浆中约70%的代谢物是脂类) 是动植物代谢物中的第一大类，是动植物代谢研究中最为关注的热点，参与能量运输、细胞间的信息通讯与网络调控等生长发育过程中的必需事件。作为细胞膜和脂滴的主要组成成分，各种结构的脂类在广泛的生物学过程，如信号传导、运输作用以及具有不同生化性质的生物大分子分选过程中，扮演着重要角色。
Q:
为什么要做质谱成像研究？
A:
空间代谢组学（Spatial Metabolomics）将代谢组学信息扩展到了二维乃至三维的水平，研究小分子在组织切片中的空间分布，告诉我们变化“在哪里发生”，从而极大拓展了对代谢组学样品信息的认知，实现高空间分辨精准定位组织中代谢物的分布对阐明代谢物的合成、积累和调控机理至关重要。
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