从 2D 到 3D 培养
一个多世纪以来，2D 细胞培养被用作体外模型来研究细胞对生物物理和生化刺激的反应。尽管这些方法已被广泛接受，并显著提高了我们对细胞行为的理解，但越来越多的证据表明，在某些情况下，2D 可能造成体内反应的细胞生物活性的明显偏离，例如，癌细胞的一些重要特征不能在 2D 培养中恰当的建模。为了克服这一限制，人们正在创造新的 3D 细胞培养平台以更好地模拟体内条件，也称之为细胞球或类器官培养 1。
3D 细胞培养物具有贴切概括人体组织各个方面的优势，这些方面包括结构、细胞组织、细胞间和细胞基质间的相互作用以及更具生理相关性的扩散特性。通过 3D 细胞分析可增加研究和筛选活动的价值，跨越 2D 细胞培养物与整个动物模型之间的转化差距。通过模拟体内环境的重要参数，3D 模型可提供有关干细胞行为以及体外组织发展的独到见解。
另外，3D 细胞培养目前也广泛应用于药物发现、药理学研究、细胞生理学、基因和蛋白质表达、癌症研究、组织工程等领域 2。而随着近年来成像技术的不断进步，我们现在能够以三维的方式观察和分析复杂的细胞网络。通过 3D 成像，我们可以更详细、更准确地获取和分析细胞和组织之间的相互作用。
3D 细胞培养技术 3
尽管目前 3D 细胞培养和成像的优势已经得到了很好的展现，特别是在药物发现和开发方面，体外研究在很多方面更接近动物模型，但 2D 细胞培养和成像在实验室中仍然很常见，毕竟要制作完全生理学相关的 3D 细胞培养系统方面仍具有一定难度 3，相对来说 2D 研究更简单且也能再现许多生物活性的体内行为。事实上，科学家们已经意识到 3D 在表征生物学特性上更优越，与 2D 方法相比，3D 方法的一个主要优点是减少了细胞培养系统和细胞生理学之间的差距 2，而现在我们正是处在实验室广泛使用 2D 向 3D 发展的转折点上。目前估计有 40% 的实验室拥有 3D 成像设备，并且这个数字还在快速增长。3D 成像可以让发现和理解变得更快，未来这一领域将会实现强劲的增长。
实际上，灵活性、创新工具和真正的三维分析是研究人员进行精确和可重复的 3D 细胞研究的三种需求。最大的挑战之一就是 3D 样品可用于多种实验室器材中，当前并没有标准化，所以对于成像设备来说，可以灵活地获取非标准格式、尺寸和球形图像来说至关重要。其次，随着 3D 细胞培养需求的日益增多，获取和分析方面的挑战也在增加——特别是随着 3D 物体的物理尺寸的增加。科学家需要能够解决这一挑战的工具，例如水浸物镜，这样的创新既可以最小化被成像物体的光学失真，也可以收集更多的光，从而使我们可以更深入地观察样本。
最后有了真正的 3D 分析，我们可以创建连接各种数据点的 3D 图像，识别和测量甚至跨越多个平面给到细胞或细胞球更全面的信息。例如对肿瘤细胞进行 3D 分析，科学家已经能够追踪和测量 3D 肿瘤模型的渗透情况从而确定可能削弱肿瘤的化合物，这种方式在 2D 研究中是不可能实现的。
典型 3D 细胞培养物检测的步骤
总之，随着技术的发展，3D 细胞培养及成像会成为越来越有吸引力的研究选择，而帮助研究人员实现从 2D 到 3D 研究的转变是我们 Molecular Devices 首要思想。我们致力于仪器的易用性、灵活性及与其他公司合作的开放性，以便于 3D 细胞培养的广泛普及。
克服高通量 3D 成像的挑战
众所周知，3D 成像是一个复杂的过程，从图像扫描时间长到分辨率低和分析工具不足等诸多复杂问题。这里总结了在 3D 细胞成像中面临的常见挑战，以及我们提供的解决方案。
主要问题
非焦平面杂散光
过长的图片获取时间
可靠的自动聚焦
数据分析
光的样品穿透能力
高内涵数据挖掘
01
非焦平面杂散光
获得清晰的 3D 图像是一项挑战，特别是如果你使用的是宽场显微镜。尽管宽场显微镜提供了快速的图像采集，但在消除非焦平面杂散光方面做得不够。这使得拍摄的图像在强烈的非焦平面杂散光影响下变得模糊，妨碍了你的图像分析。
如果我们选择了带有针孔的共聚焦显微镜，当聚焦到焦平面时，只有焦平面的光可以被采集，非焦平面杂散光被过滤，进而可以产生更加清晰的图像。但是对于单一针孔的点扫显微镜来说，要得到一张清晰的二维图像，需要“由点到线、由线到面”的采集方式，非常耗时。
这就是转盘式共聚焦显微镜（SCDM）可以作为升级的地方。与单一针孔的点扫显微镜不同，SDCM 由数百个按一定顺序排列的针孔组成，它们通过快速旋转来扫描样本，从而在短时间内获得具有更好的分辨率的图像。AgileOptix 转盘式共焦技术就是一个很好的例子。
ImageXpress Micro Confocal 系统采用了革命性的 AgileOptix 转盘式共聚焦技术，搭配使用高强度激光光源进行更深层次的组织穿透，因此即使是较厚的组织样本，也可以获得高分辨率的图像。因此，你不但可以获得更清晰的图像，又能提高细胞的可见性使细胞数量至少增加 30%。
02
过长的图片获取时间
在 3D 激光扫描技术之前，最大的挑战就是获取高质量的图像通常需要长时间的曝光，因为 3D 图像样本较厚。而现在共聚焦显微镜可通过高强度激光光源来解决这个问题。
高强度光源不仅可以改善图像质量，还可以通过减少曝光时间来提高扫描速度。ImageXpress Confocal HT.ai 拥有 7 色激光光源、8 个成像通道，可减少高达 75% 的曝光时间，从而将整体扫描速度提高了一倍。
03
可靠的自动聚焦
在热能和机械振动的影响下，能否可以保持聚焦在样本相同位置是一个挑战，尤其是对于延时成像实验。这就是为什么你的显微镜应该自动检测并稳定焦平面。基于相机的自动对焦系统很费时，因为要在一个大范围的聚焦范围内搜索进行预对焦过程。
随着激光自动对焦技术的发展，目前可以加速对各种类型的板的自动对焦，包括器官芯片和 u 型底的板。
值得一提的是，由激光自动对焦和基于图像的自动对焦组成的混合自动对焦系统将产生最佳的结果。这种类型的自动对焦速度要快得多，因为激光器每孔只闪烁一次。最重要的是，最低强度的激光照射意味着光毒性的风险的减少，这在活细胞分析中是至关重要的。
04
数据分析
数据分析中，数据通常量大又复杂，所以可能需要几个小时才能分析完成。要克服这一苦困难，需要具有加速处理、精确图像分类和简单用户界面的尖端图像分析工具。
Molecular Devices 图像分析工具因其具有解决各种分析需求的特性而脱颖而出。
例如，您是否知道使用多线程并行处理可以将延时分析速度提高 40 倍？对于我们的 MetaXpress 高内涵成像系统采集和分析软件处理 2D 和 3D 图像来说，这已经成为现实。图像分析的另一个挑战是细胞群的分类，用于全面的细胞表征。这就是机器自主学习发挥作用的地方，我们的 IN Carta 图像分析软件可以根据细胞复杂的形态将细胞自动分类。
使用 MetaXpress 高内涵成像分析系统，您可以在几分钟内使用各种样例运行进程，并具有极佳的用户体验。
05
光的样品穿透能力
3D 成像中最困难的任务之一是样本穿透，这对于获取关于样本复杂生物行为的信息至关重要。如果显微镜的穿透深度有限，当光线散射或被厚组织样本吸收时，图像质量会下降。
正如我们前面提到的，共聚焦显微镜可以提供更好的分辨率，并能进行更深层的样本穿透。
将共聚焦显微镜与高强度激光光学相结合，可以通过更长波长的光来激发荧光样品，而不会损坏样品，从而实现样本更深的穿透。
06
高内涵数据挖掘
想象一下将多孔和多板数据可视化带来的方便。如果使用独立的 3D 成像软件，您可能需要在多个应用程序之间切换，以查看多个图像缩略图和热图。
为了更好的进行数据挖掘，您需要能够将图像采集与图像分析和信息学集成在一起的信息学软件，这样您就可以直接从原始图像中分析数据。基于这一目的，我们开发了 AcuityXpress 高内涵信息学软件。
该软件拥有交互式缩放功能，可以让您在图像和数字数据之间切换自如。有了这项技术，你就可以在同个屏幕中进行单个高质量图片或所有图像和数据的缩放。除了最先进的导航树，AcuityXpress 软件提供了充足的分析和计算工具，为您解释复杂的数据和多个参数提供了方便。
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★总结
3D 细胞培养技术已经成为基本发育过程和人类疾病的体外建模不可或缺的技术。3D 细胞培养对活体组织复杂环境进行逼真建模，加快了我们对哺乳动物器官和癌症发生的理解，并将有利于开发更先进的药物检测和个性化医疗方法 3。3D 成像在为您的细胞样品的复杂行为带来更深刻的见解的同时同时也带来了一些挑战。Molecular Devices 致力于为您解决成像问题，提供指导性的具体解决方案——从在几分钟内获得更清晰的图像，到将数据组织到一个集中的软件系统进行分析，我们助力加快您的研究进程。
参考文献：
[1] Duval K , Grover H , Han L H , et al. Modeling Physiological Events in 2D vs. 3D Cell Culture[J]. Physiology, 2017, 32(4):266.
[2] Ravi M , Paramesh V , Kaviya S R , et al. 3D Cell Culture Systems: Advantages and Applications[J]. Journal of Cellular Physiology, 2015, 230(1):5-26.
[3]Koledova, Zuzana. 3D Cell Culture: An Introduction[J]. Methods in Molecular Biology, 2017, 1612(Chapter 1):1.
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