本文作者：黄春筱 博士
同济大学医学院
1.脊髓 CPG与斑马鱼模型
人和动物的行走、奔跑、游泳、爬行等运动行为被称为脊髓躯体运动，控制脊髓躯体运动的神经中枢被称为 “脊髓中央模式产生器 (Spinal Central Pattern Generator, 脊髓 CPG)”
图1：脊髓中央模式产生器的作用（图片来源于网络）
车祸、自然灾害等造成的严重外伤极易引发脊髓损伤，进而导致机体运动、感觉等多种功能障碍，严重影响患者生活质量及平均寿命，给其家庭和社会带来极大的经济负担。目前临床针对脊髓损伤的治疗，依然是固定和康复治疗，无法做到有效根治。
图2：脊髓损伤（图片来源于网络）
因此，聚焦于脊髓损伤后的神经生长和环路重建的疗法，则有望为上述患者提供更优的治疗方案。
相较于成年鼠等哺乳动物脊髓再生修复能力低下，成年斑马鱼脊髓再生能力强，损伤后4-6周便可以恢复运动功能，是研究脊髓内源性修复机制的好模型。
图3：用于脊髓损伤研究的斑马鱼模型（图片来源于网络）
通过斑马鱼神经系统再生和脊髓损伤后修复的研究，可以使人们了解控制脊髓CPG中间神经元轴突再生和脊髓横断后局部CPG重连的内在机制。
2.脊髓损伤后的轴突再生和功能恢复
2021年12月7日，同济大学医学院 宋建人教授，在Nature Communications杂志上在线发表了研究长文“An injury-induced serotonergic neuron subpopulation contributes to axon regrowth and function restoration after spinal cord injury in zebrafish”（一类脊髓损伤后诱导形成的5-HT神经元亚群有助于斑马鱼脊髓损伤后的轴突再生和功能恢复）。
该研究利用斑马鱼脊髓双切断损伤模型，在损伤部位成功发现了一类特定的5-HT神经元亚群，该群神经元细胞，只在脊髓损伤部分形成，并不受上游5-HT神经元的影响。在斑马鱼脊髓损伤后的轴突再生和运动功能恢复中起到重要作用。
在该研究中，研究人员使用了脊髓双切断模型，在不同时间分别切断了斑马鱼的第7和第12节脊髓，用于观察脊髓损伤后神经元再生情况。
研究人员借助于Tg(tph2:GFP)转基因系，其神经元表达GFP分子，且其中97%的神经元表达血清素。将RD注射于损伤远端部位，通过逆向标记来量化轴突再生相关脊髓中间神经元的变化（图4），结果显示斑马鱼脊髓损伤后再生的脊髓中间神经元，是固有的脊髓内的反应，与上游神经元无关。
图4 免疫组化成像显示双切断斑马鱼模型在不同的时间后脊髓中间神经元恢复情况
（该图由Olympus FV3000拍摄得到）
利用Tg(tph2:Gal4;UAS:nfsB-mCherry)转基因系（图5），进一步验证了脊髓损伤后诱导形成的单独脊髓中间神经元即可促进神经轴突的再生、神经环路重建及运动功能的恢复。
图5 免疫组化成像显示双切断斑马鱼模型在有/无MTZ干预下脊髓中间神经元恢复情况
（该图由Olympus FV3000拍摄得到）
研究人员利用Tg(vglut2a:Gal4;UAS:GFP) 和Tg(glyt2:GFP)转基因斑马鱼系，对脊髓损伤后轴突再生的兴奋性中间神经元和抑制性中间神经元比例进行分析，发现80%轴突再生的神经元是兴奋性中间神经元（图6）。
图6 免疫组化成像显示脊髓损伤后轴突再生的兴奋性中间神经元和抑制性中间神经元恢复情况
（该图由Olympus FV3000拍摄得到）
脊髓损伤诱导形成的脊髓中间神经元具有成熟神经元细胞的特性，但是又有着与损伤部位远端神经元细胞不同的电位表现和钙离子浓度变化情况，因此这是一群与非损伤脊髓部位内神经元不同类型的细胞。
再生的脊髓中间神经元被损伤部位远端神经元轴突包裹缠绕，表现出更活跃的电生理特性，释放更多的5-HT，从而促进轴突再生和环路重建（图7）。
图7 脊髓损伤部位全细胞膜片钳记录电压变化情况
以上研究用充分的数据证实了脊髓内 5-羟色胺能系统的局部增强可能具备提供重建哺乳动物脊髓运动回路的潜力。
同时研究人员证实5-HT1B 受体在脊髓神经修复中具有重要作用，而损伤诱导后形成的脊髓中间神经元也会是一类潜在的治疗用细胞，可以促进脊髓 CPG 的重组和脊髓损伤后运动功能的恢复。
3.显微成像的实验技巧
本研究中，针对斑马鱼脊髓的高分辨率宏观成像均采用Olympus FV3000共聚焦系统。FV3000优异的光路设计，支持从1.25倍到150倍等不同放大倍数的物镜，特别适合此类从宏观到微观观察组织标本。
实验过程中，可先利用低倍物镜对整个组织样本进行快速宏观成像，精准定位感兴趣区域；再切换至高倍物镜，利用聚焦地形图（Focus Map）功能，根据样品表面高度和厚度在不同区域设置最佳焦平面，从而进行高分辨率全视野成像或局部感兴趣区域成像，获得极佳的成像效果。
整套一体化的采集流程，能够大幅提升科研工作者的实验效率。
参考文献：
1.https://www.msdmanuals.cn/home/injuries-and-poisoning/spinal-injuries/injuries-of-the-spinal-cord-and-vertebrae
2.Huang, CX., Zhao, Y., Mao, J. et al. An injury-induced serotonergic neuron subpopulation contributes to axon regrowth and function restoration after spinal cord injury in zebrafish. Nat Commun. 12, 7093 (2021).
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