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美谷分子仪器

2022.3.04

作者美谷分子仪器

TA的动态

简介

人类 hERG 相关基因 ( human ether-a go-go-related gene )编码的快速激活延迟整流钾电流 ( IKr ) 是心肌细胞动作电位 3 期复极化的主要电流成分。药物诱导的 hERG 钾通道抑制能够引起心室延迟复极(长 QT 间期综合征)，并可能引发尖端扭转室速等致命性心律失常，甚至猝死。

近年来，一批 FDA 已批准药物由于其对 hERG 的脱靶效应而被迫从市场上撤出。为此，2005 年国际协调会 ICH 颁布的指导原则 S7B 建议所有的药物均需要评估其对心肌延迟复极的作用，美国 FDA 及欧洲 EMEA 等药物监管部门也均要求新药申报时必须有 hERG 心脏安全性的评价资料。我国药物的心脏毒性问题也越来越引起药物监管部门重视，并成为影响新药临床实验及上市的重要风险因素。因此，愈发凸显了在药物研发早期阶段开展候选药物 hERG 安全性筛选的重要性和快速增长的需求。

在此，小编向您介绍一种新型钾离子通道检测试剂盒研究 hERG 化合物活性的新方法。该试剂盒根据钾离子( K+ ) 通道对铊离子( Tl+ ) 的通透性，采用了对 Tl+ 敏感的荧光染料作为指示剂。使用该试剂盒在 FLIPR 高通量实时荧光成像分析系统和 FlexStation 3 多功能酶标仪上对 hERG 通道 7 种阳性阻断剂的药理效应进行评估和检测，结果与全自动膜片钳系统收集的数据作比较。

实验结果

应用 FLIPR 钾通道检测试剂盒对 7 个已知的 hERG 阻断剂的效应进行评估。FLIPR 系统的量效反应曲线见图 1 上，FlexStation 3 系统的量效反应曲线见图1 下。两个系统检测得到的 IC50 值与全自动膜片钳系统检测的 IC50 的比较见表 1 ，这三种检测系统中的 IC50 值在半对数（ 1/2log ）范围内具有很好的相关性，化合物效价的排序保持不变。

图 1 上. 阳性化合物对 hERG 通道的浓度依赖性

阻断效应，FLIPR 系统收集的数据。

图 1 下. 阳性化合物对 hERG 通道的浓度依赖性

阻断效应，FlexStation 3 系统收集的数据。

表 1 . FLIPR 钾离子通道检测试剂盒，

在 FlexStation 3 酶标仪、 FLIPR 和

全自动膜片钳三套系统上得到的

IC50 值进行对比。

为了进行对比，使用FluxOR试剂盒（Life Technologies）进行了平行实验，依照生产厂家提供的方案进行操作。两个试剂盒所得到的 IC50 值很接近，具体见表 2 。然而，FLIPR 钾离子通道检测试剂盒的信号窗口是 2.25 （见图 2 ），这一数值显著高于 FluxOR（信号窗口是 0.5 ）。表明了 FLIPR 钾离子通道检测试剂盒的实验结果更精确、更可靠。另外，更低的空间差异和更大的信号窗口产生了更高的 Z 因子值，见图 3 ，这可能源于 FLIPR 钾离子通道检测试剂盒是真正的均相实验体系且是免洗的或无需更换培养基，从而显著减小了孔间差异性。

图 2 . FLIPR 钾离子通道检测试剂盒与

FluxOR 结果对比。

表2. 源自 FLIPR 钾离子通道检测试剂盒的

IC50 值与 FluxOR 试剂盒的对比表。

图 3 . FLIPR 钾离子通道检测试剂盒的信号动态范围与 FluxOR 的对比。阴性对照是 4μM 特非那定，阳性对照是刺激性缓冲液。FLIPR 钾离子通道检测试剂盒的 Z’= 0.85，n = 32；FluxOR 的 Z’ = 0.64 ，n = 30。

结论

FLIPR 钾离子通道检测试剂盒采用均相免洗的实验方案检测钾离子通道的功能活性。在本次实验中，我们使用hERG 通道阳性抑制剂验证了 FLIPR 钾离子通道检测试剂盒和电生理方法得到的结果是高度相关的。

另一组实验中，FLIPR 钾离子通道检测试剂盒相比于竞争试剂盒产品，显示了明显更大的试验窗口和更高的 Z 因子。明显提升的实验结果表现，结合 FlexStation 3 多功能酶标仪的中等通量能力或者 FLIPR 系统的高通量能力，在药物研发早期阶段将为研究者提供一种强大的 hERG 风险评估分析平台。

实验方法和步骤

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小知识

FLIPR 钾离子通道检测试剂盒采用对铊离子( Tl+ ) 敏感的荧光染料作为指示剂，含有乙酰氧基甲（AM）酯的铊离子指示染料通过被动扩散穿过细胞膜进入细胞内，细胞质酯酶剪切掉乙酰氧基甲（AM）酯并释放出其活化的荧光形态。另外，在细胞外采用屏蔽染料技术从而降低了背景荧光信号的干扰。通过向细胞溶液中加入混合的 K+ 和 Tl+ 或包含了 Tl+ 的配体来激活钾离子通道，细胞外的 Tl+ 通过开放的 hERG 钾通道顺浓度梯度进入细胞内，与荧光染料结合后产生荧光。