项目文章 | 复旦大学唐建国团队多组学揭示大蒜素(DADS)缓解肠炎下白色念珠菌感染新机理

鹿明生物

2022.3.24

作者欧易生物

TA的动态

前言

2022年，复旦大学上海市第五人民医院创伤急危重症医学科唐建国教授课题组在Frontiers in Cellular and Infection Microbiology期刊发表的题为“Diallyl Disulfide (DADS) Ameliorates Intestinal Candida albicans Infection by Modulating the Gut microbiota and Metabolites and Providing Intestinal Protection in Mice”的研究成果，通过粪便微生物16S rRNA测序和粪便LC-MS代谢组学研究方法，发现了DADS 显著减轻了 DSS 诱导下肠道白色念珠菌感染，并改变了小鼠肠道微生物群落结构和代谢特征，探究了DADS 可以调节肠道微生物群和代谢物并保护肠道屏障的内在机理，为治疗白色念珠菌感染提供了理论依据。

基本信息

中文标题：二烯丙基二硫化物(DADS)通过调节肠道微生物群和代谢物来保护小鼠肠道及改善白色念珠菌感染

研究对象：小鼠粪便

发表期刊：Frontiers in Cellular and Infection Microbiology

影响因子：5.293

发表时间：2022 年 1 月 7 日

合作单位：复旦大学上海市第五人民医院创伤急危重症医学科

运用生物技术：粪便代谢组分析（由鹿明生物提供技术支持）、微生物16S rRNA测序

研究背景

白色念珠菌是人类最常见的病原体，是人体肠道微生物群的正常组成部分。肠道屏障受损在肠道菌群失调和真菌病中也起着重要作用。因此，了解和预防与白色念珠菌感染相关的疾病具有重要意义。越来越多的研究表明，肠道微生物群、代谢物和肠道屏障可能影响白色念珠菌的侵袭。研究表明，炎症性肠病(IBD)与结肠内微生物和代谢环境的变化有关，参与信号转导和免疫系统调节、影响抗生素的活性，肠道细菌产生的一些代谢物可以调节肠上皮和免疫功能，然而很少有研究人员将肠道微生物群的研究与肠道白色念珠菌感染期间粪便代谢物变化的研究结合起来。

大蒜作为一种日常食用的食物，也是一种由来已久的常用中药。大蒜中的有效成分是二烯丙基二硫醚(DADS)，又称大蒜素，具有抗真菌、抗菌、抗肿瘤等作用，可改善心血管疾病，然而，涉及DADS治疗肠源性白色念珠菌感染的动物实验尚未见报道，治疗机制是否涉及肠道菌群，代谢物和肠道屏障尚未研究。本研究通过DSS诱导肠道破坏建立更能代表人体肠源性白念珠菌感染的动物模型，探索 DADS 治疗的机制。

研究思路

研究结果

在DSS小鼠模型中诱导肠道白色念珠菌感染

作者评估了 DADS 是否可以在肠道白色念珠菌感染性小鼠模型中发挥抗真菌和抗炎作用（图 1）。在用 3% DSS 处理并用白色念珠菌重复灌胃后，粪便白色念珠菌水平维持在 104 CFU/g 粪便（图 1A、B）。随后作者用三种浓度的 DADS 处理感染的小鼠：6、20 和 40 mg/kg（图 1C）进行了实验设计。

图1 |动物实验设计示意图

a)动物模型中白色念珠菌感染的示意图

b)粪便中的真菌负担

c)比较不同浓度DADS作用的实验示意图。使用 METABRIC 数据集使用 CTR1 或 SLC31A1 表达的患者存活率

不同浓度 DADS 对白念珠菌感染小鼠的影响

通过评估存活率、结肠长度和疾病活动指数，确定 20 mg/kg DADS 的剂量适合后续实验组（图2）。75只雌性小鼠随机分为五组：对照组、DSS、CA + DSS（6 mg/kg）、CA + DSS + DADS（20 mg/kg）和DSS + DADS（40 mg/kg）。治疗十五天后，收集所有小鼠的粪便并储存在-80°C。通过眶后穿刺采血，然后通过颈脱位处死小鼠并收获它们的结肠和脾脏。

图2 | 不同浓度 DADS 对白念珠菌感染小鼠的影响生存研究

a)结肠长度

b)结肠长度相关统计分析

c)各组动物的疾病活动指数

DSS 诱导的肠道白色念珠菌感染通过 20 mg/kg DADS 在小鼠中得到缓解

根据实验结果，20 mg/kg 被认为是以下实验分组的最佳DADS 浓度（图 3A）。以DSS诱导结肠损伤的小鼠为模型对照组(DSS)，以DSS+DADS治疗的小鼠为实验组。虽然施用 DSS 和白色念珠菌显著降低了小鼠的体重和存活率，但 DADS 治疗减轻了这些影响（图 3B、C）。此外，与 CA + DSS 组相比，DADS 治疗导致粪便白色念珠菌的负荷显著降低（图 3D，E）。这些数据表明，与 6 mg/kg 相比，20 mg/kg DADS 治疗可以更好地缓解 DSS 诱导的小鼠肠道白色念珠菌感染。至于 40 mg/kg DADS，则没有改善。

图3 | DADS 减轻了白色念珠菌感染小鼠的症状

a)白色念珠菌灌胃感染和 20 mg/kg DADS 给药示意图

b)体重变化

c)生存研究

d)粪便中的真菌负担

e)粪便中的真菌负担

DADS 在感染白色念珠菌的小鼠中表现出抗炎作用

脾脏大小可以反映小鼠的炎症。DSS 和白色念珠菌增加了脾脏/体重比，DADS 显著改善了这一点（图 4A、B）。此外，作者使用 ELISA 来量化促炎细胞因子的表达，即 IL-6 和 IFN-γ。值得注意的是，DSS 和白色念珠菌导致血清和结肠中 IL-6 和 IFN-γ 的显著增加，这些变化可以通过 DADS 治疗逆转（图 4C、D）。为了研究 DADS 对肠道炎症的影响，比较各组之间的结肠长度和组织学变化。与上述结果一致，DADS 改善了在用 DSS 和白色念珠菌治疗的小鼠中观察到的结肠缩短（图 5A、B)。

图4 | DADS 在感染白色念珠菌的小鼠中表现出抗炎作用

a)脾脏大小和脾脏/体重比

b)脾脏/体重比

c)结肠中 IL-6 和 IFN-γ 的浓度

d)血清中 IL-6 和 IFN-γ 的浓度

DADS 保护了白色念珠菌感染小鼠的上皮屏障。

组织学检查结果显示，白念珠菌感染小鼠的黏膜腺体部分丧失，黏膜下层和肌肉层侵蚀，中性粒细胞浸润增加，DADS 可缓解这种情况（图 5C、D）。还通过量化血清中的 FITC 含量来评估对肠道的损伤，这表明 DADS 可以改善 DSS 和 CA + DADS 组中增加的通透性（图 5E）。此外，还定量分析了结肠中紧密连接蛋白Claudin-1和Occludin的表达水平；这些蛋白质在肠道白色念珠菌中显著减少感染小鼠并在 CA + DSS + DADS 组中得到改善（图 5F，G ）。这些数据表明，DADS治疗可以改善DSS和白色念珠菌对肠道屏障的损害。

图5 | DADS 保护了白色念珠菌感染小鼠的上皮屏障

a)结肠长度

b)结肠长度相关统计分析

c)结肠病理变化的H&E染色

d)结肠病理变化相关评分

e)血清中的 FITC 水平

f)紧密连接蛋白的水平

g)紧密连接蛋白的水平统计

DADS 改变了 DSS 诱导的肠道白色念珠菌感染小鼠的肠道微生物群落组成

PCA 显示白色念珠菌、DSS 和 DADS 治疗诱导了肠道微生物群组成的变化。此外，来自 DSS 和 CA + DSS 组的粪便样本以高度相似性聚集在一起，但在 DADS 处理的小鼠中，来自 CA + DSS + DADS 组的样本与对照样本聚集在一起（图 6A）。PCA 还区分了 CA + DSS 和 CA + DSS + DADS 组，这表明这些肠道微生物群落存在显著差异（图 6B）。如图 3C、D所示，作者确定了组间属水平前 15 种细菌的相对丰度。拟杆菌属、大肠杆菌-志贺氏菌属、Lachnospiraceae_ NK4A136_group、Parabacteroides等在所有组中都表现出较高的相对丰度。与白色念珠菌感染的小鼠相比，DADS 治疗组的大肠杆菌-志贺氏菌和副杆菌属的相对丰度降低。

关键细菌通过热图可视化并通过 Wilcoxon 秩和检验进行分析（图 7A、B）。在门水平上，与肠道白色念珠菌感染组相比，DADS 治疗与 Proteobacteria 丰度降低（P = 0.019，图 7C）和 Tenericutes 丰度增加（P = 0.002，图 7D ）相关（P < 0.05）（图 7A）。如图 7B所示，在属水平上，大肠杆菌-志贺氏菌（P = 0.014，图 7E）、粪杆菌（P = 0.027，图 7F）、副拟杆菌（P = 0.001，图 7G）和链球菌（P = 0.023，图 7H）显著下降，而普氏菌科_NK3B31_group（P = 0.002，图 7I）、瘤胃梭菌（P = 0.023，图 7J）、瘤胃球菌科_UCG -013（P = 0.002，图 7K ) 和颤杆菌 ( P = 0.038，图 7L ) 在 DADS 处理的小鼠中富集。

图6 | DADS 改变了白色念珠菌感染小鼠的肠道微生物群落组成

a)主成分分析

b)CA + DSS 和 CA + DSS + DADS 组主成分分析

c)组间属水平前 15 种细菌的相对丰度

图6 | 关键细菌体现

a)门水平的关键细菌热图

b)属水平的关键细菌热图

c)Proteobacteria相对丰度

d)Tenericutes 相对丰度

e)Escherichia–Shigella相对丰度

f)Faecalibacterium相对丰度

g)Parabacteroides相对丰度

h)Streptococcus相对丰度

i)Prevotellaceae_NK3B31_group 相对丰度

j)Ruminiclostridium 相对丰度

k)Ruminococcaceae_UCG的相对丰度

l)Oscillibacter相对丰度

DADS 改善了 DSS 诱导的肠道白色念珠菌感染小鼠的粪便代谢物谱

代谢变化与肠道微生物群的改变密切相关，也被认为是肠道炎症的重要标志。因此，作者进行了 LC-MS 非靶代谢分析以检测组间差异表达的代谢物和相关的关键代谢途径。在五组中的 30 个粪便样本中共鉴定出 8,689 种代谢物。PCA 散点图显示了聚集的 QC 样品，这表明代谢组学分析的质量很高（图 8A）。

作者使用二维 PCA、PLS-DA 和 OPLS-DA 分析进一步确定了 CA + DSS 和 20 mg/kg DADS 治疗组之间代谢特征的差异（图 8B-D）. 接下来，为了识别关键代谢物，作者在热图上可视化了前 50 种代谢物，并确定了在白色念珠菌感染小鼠和 DADS 治疗小鼠之间显著差异表达的 19 种代谢途径（P < 0.05，图 8E，F）。

此外，作者确定了 17 种重要的代谢物，以便在两组之间进行进一步分析。所有与色氨酸代谢相关的差异表达代谢物在 DADS 组中均上调，包括 4-(2-氨基苯基)-2,4-二氧代丁酸、犬尿酸、N-乙酰靛红、5-羟基吲哚乙酸、喹啉-4,8-二醇, 4-(2-amino-3-hydroxyphenyl)-2,4-dioxobutanoic acid, 3-methyldioxyindole, 和 2-formaminobenzoylacetate。与感染白色念珠菌的小鼠相比，DADS 治疗的小鼠中的一些代谢物，如 PGB2、PGD2、TXA2 和脂氧素 A4 的水平升高。此外，胆汁分泌途径的一些代谢物在 DADS 治疗的小鼠中处于较高水平，包括脱氧胆酸、石胆酸、鹅去氧胆酸和胆酸。