ACD/Labs
本文内容是2022年4月1日同写意系统化分析方法开发系列网络培训的第二讲的部分内容。应听众的要求，我们将把此次系列演说的内容以文字的形式重现，以期令更多的读者可以有更深入的学习和讨论的机会。
今天给各位带来的内容分三部分。首先介绍项目的背景情况，包括ACD/Percepta模块在药物分析方法开发中的应用介绍。其次是实验设计，基于色谱基本理论进行风险评估及实验设计。最后是实验结果与讨论部分。探讨如何利用软件进行建模和结果分析，开发可靠耐用的分析方法。
本案例的项目背景介绍：在进行改良型新药的药典分析方法确认时，发现主峰与相邻杂质B之间分离度不稳定。有时分离度能达到2.6，但有时分离度可能低于1.5，不满足系统适用性要求。色谱条件如图所示。通过排查不同厂家、不同批号色谱柱、改变流动相比例、更换稀释剂等手段均未能找到引起分离度不稳定的根本原因。于是考虑使用ACD软件辅助分析方法开发。
在方法开发之前，先研究清楚所需研究杂质，以免在分析方法开发过程中产生新的杂质分离问题。结合制剂的制备工艺，使用原料药分别在高温140℃和强酸条件下进行强制降解实验。产生的降解杂质主要包括杂质D、杂质B、杂质H和杂质I。故将这4个杂质作为制剂产品中可能存在的已知杂质进行研究。
根据API和各已知杂质结构绘制LogD曲线。从LogD曲线结果分析，API和杂质D属于酸性化合物。在低pH条件下呈分子态，LogD值较高。随着pH升高逐渐解离成离子态，LogD值降低。而杂质B、H、I均为中性分子，其LogD值不随pH的变化而变化。另外，所有化合物的LogD值均大于-2，说明这些化合物在普通C18柱均能有所保留。
Percepta不仅可以用于理化性质的预测（如LogP，LogD，pKa及水溶性），还可以用于ADME及毒性预测，在化合物成药性研究中具有重大意义。
本案例主要存在的问题是分离度问题，首先需要了解分离度公式，影响分离度的三个参数分别为保留因子k，选择因子α及柱效N。其中柱效N为动力学影响因素（物理相关），主要与色谱柱参数相关。而k与α则为热力学影响因素（化学相关）。从表中可看出，影响k与α比较显著的因素包括有机溶剂的种类和比例、色谱柱类型、流动相pH、离子对试剂的浓度等（表中带++的因素）。而根据前期预实验发现改变有机溶剂的种类对分离度改善不明显。故将梯度和pH作为关键方法参数进行后续的考察。
进行流动相pH考察应注意不同的盐缓冲范围不同。如本案例中须考察pH2.0，pH3.0及pH5.0可分别使用磷酸盐及醋酸盐。
设计3个不同水平的梯度，梯度时间分别为25min、40min及55min，使有机溶剂比例从10%上升至45%。
经验公式logk = logkw–SΦ解释了有机溶剂比例如何影响化合物的保留。随着有机溶剂比例的改变，不同化合物之间出峰顺序没有发生改变即为规则样品。反之为不规则样品。根据经验公式，有机溶剂比例与保留因子之间应为一次项关系，但软件内置公式却为二次项关系，原因后面将会解释。
设计pH和梯度二因素三水平的正交实验，其中pH3.0条件为模拟药典方法pH。
本案例实验中使用Agilent液相，软件支持目前主流仪器厂商所出的原始数据格式。
典型图谱分析，在相同梯度，不同流动相pH条件下，杂质B、H和I的保留时间不随pH的升高及变化。而杂质D、API、杂质1和杂质2的保留时间则随pH的升高而往前移。这与化合物的LogD曲线是相吻合的。
典型图谱分析，在相同流动相pH，不同梯度条件下，所有化合物的出峰顺序并未发生变化。出峰先后顺序均为杂质D、杂质1、杂质B、API、杂质H、杂质I、杂质2。由此可知这些化合物均为规则样品。
不同仪器之间滞留体积不同，如二元泵的滞留体积小于四元泵。由于滞留体积的不同，对梯度方法的影响也不相同。在梯度变化的初期和末期，实际梯度有机溶剂的比例与保留因子k之间不呈线性关系，故软件内置公式将二者之间的关系式定义为二次项关系。
正因为滞留体积对梯度有较大的影响。故梯度建模时需要输入准确的滞留体积dwell volume。滞留体积的计算可以通过公式计算得出。另外两个必须给出的参数还有死时间t0及流速F。
死体积为进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间。近似等于色谱柱未被固定相占据的空体积。可根据公式求得。
死体积（V0）=(π*d2*L*孔隙率)/4
再根据公式可计算得出死时间t0。
死时间(t0)=死体积/流速
软件根据正交实验的9个色谱图数据构建模型（pH和梯度两因素建模）。其中黑色表示实测数据，绿色表示软件模拟数据。由图可知模拟数据与实测数据基本一致。表明模型准确性良好。将API与杂质B的实测值与预测值进行线性回归，相关系数均为1。同样表明模型准确性良好。
从分离度图可知，当梯度时间为15min，流动相pH为4.0时得到较为良好的耐用性区间可实现最小分离度大于3.0。从预测色谱图可判断，在该条件下杂质B与API之间不存在分离度问题。最小分离度为杂质H和杂质I之间，它们之间的分离度也能达到3.9。
再看药典方法，当pH3.0时为何会出现问题。软件提示药典方法pH3.0处于耐用性的边界上，在pH3.0基础上如果稍调低pH，分离度没有问题。但在pH3.0基础上如果调高pH则可能导致分离度下降。这可能是前期使用药典方法频繁出现分离度不稳定性的根本原因。
根据分离度图得知，当梯度时间为15min，流动相pH值为4.0时可使最小分离度达到3.0以上。重现该方法，与预测色谱图进行对比。完美重现了预测色谱图。杂质B与API之间分离度为9.9，杂质H与杂质I之间分离度为3.6。
总结本案例的开发过程。基本是遵循AQbD的理念完成整个方法开发过程。首先需要明确方法开发目标。即提高API与杂质B之间的分离度。同时缩短运行时间。在此之前，尝试了更换色谱柱、不同有机相比例及稀释剂，均未能很好解决API与杂质之间分离度不稳定的问题。药典方法使用等度洗脱，也存在分析时间较长的问题。
接下来是明确关键方法属性，即实现分离度大于2.0。基于分离度公式进行风险评估，找出了影响分离度的关键方法参数包括有机溶剂比例及流动相pH。使用软件进行了二因素，三水平的正交实验建模分析。顺利解决了API与杂质B之间的分离度问题。更为重要的是通过软件构建数学模型，得出了分析方法的设计空间和操作空间。当流动相pH在3.9-4.2之间，梯度时间在12min-18min范围内，无论方法参数如何变化，均能实现最小分离度在3.0以上。API与杂质B的分离度不稳定问题将不复存在。
个人总结的ACD软件辅助分析方法的三重境界：
根据化合物结构进行理化性质的预测，学会分析LogD曲线。
合理设计实验，运用软件建模分析（单因素，两因素，三因素...)
理解软件的底层逻辑
要达到第三重境界，还需要不断学习，勇于探索。
一起加油！
完整视频，请
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