NIR-II 药物｜EGFR 靶向 NIR-II 探针食管鳞癌转移灶成像

恒光智影

2022.6.01

作者上海恒光智影医疗科技有限公司

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本文要点：食管鳞状细胞癌 (ESCC) 死亡率高，其主要治疗方法是手术切除。由于高度侵袭性，ESCC 在食管壁和淋巴系统中的浸润率很高，使得根治性手术对 ESCC 来说是一项艰巨的挑战。目前，ESCC 患者的预后较差，5 年生存率为 30.3% 。因此，明确界定细微病变对于改善 ESCC 患者的预后至关重要。在本研究中，旨在探讨 EGFR （表皮生长因子受体）靶向抗体探针的 NIR-II 手术导航对 ESCC 的价值。首先，结果证实 EGFR 在 ESCC 细胞系和样品中过表达。然后构建了 NIRF 探针西妥昔单抗-IR800。体外和体内研究显示 EGFR 抗体探针在 ESCC 中的特异性摄取。此外，西妥昔单抗-IR800 用于 NIR-I 和 NIR-II 窗口中原位 ESCC 模型的手术导航。因此，该研究结果强调 NIR-II 成像可以帮助识别微转移。

首先，检测 EGFR 在患者肿瘤中的临床相关性，并通过 IHC 研究 127 名原发性 ESCC 患者和相应淋巴结中的 EGFR 表达。如图 1A 和 C 数据显示，在 94.49% 的原发性 ESCC 患者和 90.63% 的 LNM 患者中发现了阳性 EGFR 染色。EGFR 在 ESCC 组织中的过表达率达到73.23% ，在 LNMs 中达到81.25% 。如图 1B 和D数据显示，肿瘤组织中和转移性淋巴结中 EGFR 的表达显着高于相邻正常组织（H 评分）。如表 1 所示，EGFR 表达与年龄、性别、肿瘤淋巴结转移、病理分期或组织学分化无关。

图 1. ESCC 患者肿瘤组织和淋巴结的免疫组织化学（A,C）ESCC 患者的代表性 EGFR 染色图像（A）肿瘤组织和（C）淋巴结的代表性 EGFR 染色图像（-：阴性染色，+：弱阳性，++：中等阳性，+++：强阳性） (B) 正常组织和肿瘤组织的 H 分数比较（H值大于100被归为“过度表达”）(D) 正常和转移性淋巴结的 H 评分比较

表1：ESCC 中的 EGFR 表达特征

其次，研究EGFR的表达和西妥昔单抗与癌细胞的结合。使用蛋白质印迹评估 ESCC 细胞中的 EGFR 蛋白表达（图 2A）。定量分析显示 EGFR 蛋白在 KYSE-30 中的表达最高。因此，KYSE-30 被选为 EGFR 阳性细胞系进行体外和体内研究，相反卵巢癌细胞系 A2780 被用作阴性对照（图 2B）。共聚焦成像显示 EGFR 蛋白主要分布在 KYSE-30 细胞的膜和细胞质中，而在 A2780 细胞中检测不到该蛋白（图 2E）。西妥昔单抗的体外特异性是通过流式细胞术评估，荧光强度峰的相对位移表明西妥昔单抗-IR800 与 EGFR 阳性 KYSE-30 细胞结合，但不与 EGFR 低表达的 A2780 细胞结合（图2C）。这些结果表明 EGFR 可作为 ESCC 成像的有吸引力的靶标。正如预期的那样，西妥昔单抗和西妥昔单抗-IR800的结合能力没有显着差异，表明染料标记后西妥昔单抗的结合不受影响（图2C，D）。共焦显微成像用于评估探针与细胞的结合，EGFR 阳性细胞系 KYSE-30 与西妥昔单抗-IR800 在室温下孵育 0.5 h 时表现出更强的膜荧光，这进一步表明西妥昔单抗-IR800 的细胞结合是由 EGFR 介导的（图 2E）。

图 2. EGFR 的表达和西妥昔单抗与癌细胞系的结合 (A) 蛋白质印迹用于确定 ESCC 细胞系和阴性对照卵巢癌细胞系中的 EGFR 表达 (B) ESCC 细胞系中 EGFR 表达的量化 (C, D) 流式细胞仪分析和量化染料标记抗体或裸抗体的细胞结合。通过染料标记的抗体或裸抗体的平均荧光强度 (MFI) 与 IgG1 的 MFI 的比值计算定量 (E) A2780 和 KYSE-30 细胞中 EGFR 抗体的细胞结合的共聚焦荧光成像

接着，对西妥昔单抗-IR800 和 IgG1-IR800 在 EGFR 阳性皮下肿瘤模型中成像。EGFR 阳性肿瘤小鼠静脉注射西妥昔单抗-IR800后，荧光在上腹部积聚(0.5 h)，并在 72 小时达到峰值。TBR 从 6 小时的 1.58 ± 0.09 增加到 120 小时的 3.95 ± 0.10。然而，注射 IgG1-IR800 在肿瘤中产生微弱的荧光，自 24 小时以来有所下降。西妥昔单抗-IR800 产生的绝对荧光值和 TBR 明显强于对照探针（图 3A-C）。对小鼠器官和肿瘤进行体外荧光成像，结果表明接受西妥昔单抗-IR800 的肿瘤比对照组荧光信号更强（图 3D，3E）。IHC 染色证实了 KYSE-30 肿瘤组织中 EGFR 的高表达和成像结果（图 3F）。冰冻切片免疫荧光显示注射西妥昔单抗的肿瘤内的荧光信号 IR800 强于 IgG1-IR800，表明靶向探针在肿瘤组织中的特异性积累。

图3. 注射西妥昔单抗-IR800或IgG1-IR800 的 KYSE-30 皮下肿瘤的体内/体外成像和探针分布 (A) 裸鼠注射前后的体内成像 (B) 肿瘤荧光强度的量化 (C) TBR 的量化。TBR，肿瘤与背景的比率 (D) 在120 小时注射探针后肿瘤和主要器官的离体成像(1 心脏、2肝脏、3脾脏、4肺、5肾脏、6胃、7肠、8结肠、9肿瘤、10脑、11胰腺）(E) 量化肿瘤和主要器官的平均荧光强度 (F) KYSE-30 肿瘤组织和肌肉的 IHC 染色 (G) 使用免疫荧光检测探针和 EGFR 蛋白的分布

紧接着，对 EGFR 阳性和 EGFR 阴性皮下肿瘤模型进行红外成像。西妥昔单抗-IR800 的特异性在 EGFR 阴性 A2780 肿瘤中进一步评估，并与 EGFR 阳性 KYSE-30 肿瘤进行比较。注射靶向探针后，KYSE-30 肿瘤表现出强烈的荧光，MFI 和 TBR 分别在 48 和 72 小时达到峰值。但 A2780 细胞对西妥昔单抗-IR800的摄取较弱，6 h后 MFI 和 TBR 均显着低于 KYSE-30 肿瘤（P < 0.05）。根据体内性能，体外成像也显示 KYSE-30 和 A2780 肿瘤之间存在显着差异（图 4A+E）。免疫荧光成像和 IHC 染色显示 KYSE-30 肿瘤中 EGFR 的表达明显强于 A2780 肿瘤（图 4F，G），这表明 EGFR 的细胞表达在肿瘤中得以维持。此外，西妥昔单抗-IR800 在 KYSE-30 细胞中的分布与 EGFR 染色共定位并且强于 A2780 细胞（图 4G）。这些发现进一步暗示目标探针的吸收是由 EGFR 诱导的。

图 4. 注射西妥昔单抗-IR800 的 KYSE-30 和 A2780 皮下肿瘤的体内/体外成像和探针的分布 (A) 注射西妥昔单抗-IR800 前后的裸鼠体内成像 (B) 肿瘤荧光强度的量化 (C) TBR 的量化(D) 在 96 小时注射探针后肿瘤和主要器官的离体成像 (1 心脏、2 肝脏、3 肺、4 脾脏、5 肾脏、6 胃、7 肠、8 结肠、9 皮肤、10 肿瘤、11胰腺，12 脑） (E) 量化肿瘤和主要器官的平均荧光强度 (F) 使用免疫荧光检测探针和 EGFR 蛋白的分布 (G) KYSE-30 和 A2780 肿瘤组织中 EGFR 蛋白的免疫组织化学染色

然后，进行 NIR-I 和 NIR-II 引导手术并比较，以验证西妥昔单抗-IR800 在 ESCC 中的价值。原位 ESCC 模型 (n = 9) 用于影像引导手术。手术导航前，9.4T T2加权 MR 图像用于扫描上腹部，显示食管下段有高信号肿块。食道壁增厚和管腔变窄与人类食道癌的特征一致（图 5A）。在探针给药后 72 小时进行了剖腹探查，发现食管下壁有一个局灶性肿块。相应位置的生物发光信号进一步证实了原位 ESCC 成功建立（图5B）。进行了原位 ESCC 肿瘤的 NIR-I 和 NIR-II 手术导航。NIR-II 的 TBR 远高于 NIR-I (2.11 ± 0.46 vs 1.58 ± 0.31, P <0.05)。TLR（肿瘤与肝脏的比率）的灰度值与 TBR 的灰度值一致（1.82 ± 0.44 vs 1.37 ± 0.25，P < 0.05）（图 5C）。采集原位肿瘤进行病理分析，包括 HE 和 IHC 染色。肿瘤侵犯食管肌层，邻近组织有微小浸润。IHC 染色表明 EGFR 在原位肿瘤中高表达（图 5D，E）。

图 5. 原位食管鳞状细胞癌的手术导航 (A) MR 成像显示食管下壁增厚和管腔变窄 (B) 用 KYSE-30-L 细胞构建的原位 ESCC 模型通过手术探查和生物发光得到证实 (C)NIR-I 和 NIR-II导航以及 ESCC 在探针注射后 72 小时的 TBR 和 TLR（D，E）原位 ESCC 的 HE 和 IHC 染色

最后，测量 1-5 毫米的生物发光阳性结节散布在原位 ESCC 周围，这意味着微转移（图 6A，B）。NIR-II 成像突出了这些细微病变中的大部分，其中一些通过肉眼检查和 NIR-I 成像无法辨别。连续灰度定量分析显示 NIR-II 中有尖锐的信号峰，与转移灶相对应，而这些病灶的信号峰在 NIR-I 中较粗或丢失。定量分析显示，NIR-II 中隐匿性转移病灶的灰度值是 NIR-I 的 2.8 倍（62.6 vs 22.2），表明 NIR-II 成像在识别 ESCC 结节方面比 NIR-I 更有效，因为原位 ESCC 中的 TBR 较高（图 6C，D）。根据生物发光和 HE 染色，NIR-II 在检测转移灶的灵敏度方面优于 NIR-I (图 6E-G)。此外，NIR-II 在原位 ESCC 附近划定了细微结节, 连续灰度定量分析也显示了与原发肿瘤相邻的小信号峰。连续灰度定量分析无法区分微小病变与原发性ESCC的信号，这些数据表明 NIR-II 比 NIR-I 具有更好的空间分辨率。

图 6. 转移性结节的手术导航 (A) 剖腹术显示食管下壁增厚 (B) 生物发光成像显示食管下段肿瘤和腹腔转移（C，D）箭头对应于 NIR-I 和 NIR-II 区域的横截面荧光强度分布的位置和方向，定量分析结果表明，与 NIR-I 相比，NIR-II 成像对 ESCC 转移的区分更有效 (E, F) 小转移瘤的 HE 和 IHC 分析 (G) NIR-I 和 NIR-II 检测到的转移灶数量

参考文献

doi: 10.1021/acs.molpharmaceut.2c00115.

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