与WB互补的验证神器！6篇文献一次解锁『高通量靶向蛋白质检测技术PRM』的魅力！

吉凯基因

2022.6.22

作者吉凯基因

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基于高通量技术的分子筛选极大便利了人类对于基因变化的研究，加速了我们对于生理病理机制的探索。但高通量技术的准确性无法达到100%，因此通过高通量筛选手段分析的差异基因其真实的变化情况依然要进行验证，如DNA和mRNA可通过qPRC进行验证，而最常见的蛋白验证手段是WB或者ELISA。这些低通量技术，针对性强、准确性高，但其通量小，效率低，对于有较多差异分子需要验证的研究者来说是个负担，尤其是用WB或ELISA验证差异蛋白。

PRM（Parallel Reaction Monitoring）作为一种基于质谱的靶向蛋白检测技术，可一次性实行对几十个目标蛋白的定量检测，极大地提高了目标蛋白验证效率。不管是用于揭示生理病理条件下的蛋白特征还是用于挖掘关键分子，蛋白质组学+PRM验证都是非常高效的技术手段。

吉凯基因提供PRM及基于4D质谱仪的PRM检测，助力科研工作者更好地进行蛋白相关研究。本文，我们带您了解文献里蛋白质组学+PRM思路的应用及单独PRM的应用，希望帮您更好地理解这项技术。

一、PRM：联合蛋白质组学，筛选潜在生物标志物

文献一

蛋白质组学筛选区分恶性前和恶性胰腺癌囊性病变的生物标志物

Highly Accurate Identification of Cystic Precursor Lesions of Pancreatic Cancer Through Targeted Mass Spectrometry: A Phase IIc Diagnostic Study

期刊：Journal of Clinical Oncology

影响因子：44.544 PMID:29166170

胰腺囊性病变是影像学上常见的一种偶尔发现，但多达一半的可能是胰腺癌的前兆。因此，准确地诊断是患者治疗的关键。目前可用的诊断方法不能可靠地识别癌前和恶性胰腺囊性病变。因此，本研究的主要目的是在多个队列中利用定量蛋白质组学发现识别和区分癌前胰腺囊性病变(PCL)与显著高级别发育异常(HGD)/癌症和囊性肿瘤的标志物。最终通过靶向蛋白的PRM检测找到了相关的蛋白标志物：粘蛋白-5AC和粘蛋白-2构成的组合在验证队列中区分恶性前/恶性病变和良性病变的准确率为97%，显著高于传统的癌胚抗原和细胞学检查的结果。粘蛋白-5AC和前列腺干细胞抗原（PSCA）联合识别高级别发育异常/癌症的准确率为96%。该研究将有助于及时进行癌症诊断并及早地进行疾病的干预或预防。

文献二

DIA蛋白质组学+PRM鉴定晚期肺癌化疗响应的生物标志物

Identification of serum biomarkers to predict pemetrexed/platinum chemotherapy efficacy for advanced lung adenocarcinoma patients by data-independent acquisition (DIA) mass spectrometry analysis with parallel reaction monitoring (PRM) verification

期刊：Translational Lung Cancer Research

影响因子：6.496 PMID: 33718037

培美曲塞/铂类化疗是肺腺癌患者的标准化疗方案，但疗效差异很大。为了发现新的血清生物标志物来预测培美曲塞/铂类化疗的疗效，作者对20例接受培美曲塞/铂类化疗的晚期肺腺癌患者的血清样本进行了DIA蛋白质组学检测。化疗响应良好组（PR）与化疗响应差（PD）组相比共得到23个差异蛋白，其中7个蛋白对于治疗响应预测的ROC AUC值高于0.8。为了进一步验证DIA蛋白质组学结果，作者使用RPM在这20名患者的研究队列和一个新的、包含22名晚期肺腺癌患者(16名PR和6名PD)的队列中检测了16个候选血清生物标志物。PRM验证与DIA蛋白质组学表现出较好的一致性，10种差异蛋白质显示出类似的上调或下调。总体，研究者通过DIA蛋白质组学和PRM验证找到了潜在的、能较好反应晚期肺腺癌治疗响应的蛋白标志物。

二、PRM：联合蛋白质组学，进行简单的机制研究

文献一

蛋白质组学+磷酸化蛋白质组学揭示新发强直性脊柱炎患者中异常的免疫调节

Global Proteomic Analyses Reveals Abnormal Immune Regulation in

Patients With New Onset Ankylosing Spondylitis

期刊：frontiers in Immunology

影响因子：7.561 PMID: 35371008

强直性脊柱炎(AS)是一种慢性炎症性疾病，具有较高的发病率和死亡率。本文，研究者对新发AS患者和健康人的外周血单个核细胞（PBMC）的蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学进行检测，并通过生信分析揭示了强直性脊柱炎患者存在的免疫调节的异常。随后，研究者对免疫调节相关差异变化蛋白（共19个）进行了PRM验证，验证结果与蛋白质组学结果高度一致，再次确认了免疫调节相关功能的异常。这些蛋白或可作为AS诊断的候选标志物和新的治疗靶点。

文献二

蛋白质组学揭示骨肉瘤细胞对IL-6干预洛铂处理的响应

Protein and Signaling Pathway Responses to rhIL-6 Intervention Before Lobaplatin Treatment in Osteosarcoma Cells

期刊：Frontiers in Oncology

影响因子：6.244 PMID:33791202

洛铂（lobaplatin）是第三代铂类抗肿瘤药物，广泛用于骨肉瘤切除前后的治疗。然而，洛铂耐药将引起治疗失败。研究者发现骨肉瘤细胞在用外源性白细胞介素-6（IL-6）处理后对洛铂变得不敏感，研究者应用蛋白质组学阐明这其中的潜在机制。

研究者对对照组、洛铂治疗组、重组人白细胞介素-6（rhIL6）和洛铂治疗组的骨肉瘤细胞进行了蛋白质组学检测，并通过PRM验证了31个差异蛋白，其中G3BP1、hFXR1p和FUBP显著差异表达。免疫组织染色和免疫荧光染色结果也显示这三个蛋白在洛铂耐药骨肉瘤患者标本中高表达，而在洛铂敏感骨肉瘤患者标本中呈阴性或弱表达。敲除FUBP1显示，在FUBP1沉默的细胞中，洛铂的IC50值显著降低，表明FUBP1缺失可增加骨肉瘤细胞对洛铂的敏感性。该结果揭示了FUBP1在骨肉瘤药物敏感性中的作用以及通过沉默FUBP1增加骨肉瘤洛铂敏感性的潜在治疗价值。

三、PRM：WB/PCR的互补技术，一次验证更多蛋白质

文献一

KIF5A依赖的轴突转运缺陷干扰三甲基氯化锡（TMT）诱导的神经毒性

KIF5A-dependent axonal transport deficiency disrupts autophagic flux in trimethyltin chloride-induced neurotoxicity

期刊：Autophagy

影响因子：16.016 PMID:32160081

三甲基氯化锡(TMT)作为杀菌剂和塑料稳定剂广泛应用于工农业领域，并被普遍认为具有较强的神经毒性，特别是在大脑海马体中。然而，TMT诱导神经毒性的机制尚不清楚。本文，研究者使用蛋白质组学和生信分析，揭示了巨自噬/自噬-溶酶体机制在TMT诱导的神经毒性中的重要作用。TMT通过抑制溶酶体功能，如抑制溶酶体蛋白水解，改变溶酶体pH值，显著损害了自噬通量，从而导致自噬清除缺陷，进而导致神经细胞死亡。在机制上，IPA分析确定了一个下调的分子——KIF5A，是TMT诱导的受损的自噬通量的关键靶点。TMT降低了KIF5A蛋白的表达，破坏了KIF5A与溶酶体之间的相互作用，并损害了溶酶体轴突转运。研究者的结果证明，在TMT诱导的神经毒性中，KIF5A依赖的轴突转运缺陷通过干扰溶酶体功能而导致自噬通量损伤，调控KIF5A可能是一种对抗TMT诱导的神经毒性的治疗方法。

本文中，在研究KIF5A逆转TMT毒性的作用中，研究者使用PRM靶向检测了TMT处理的KIF5A过表达细胞中与自噬相关的蛋白的表达，并通过比较发现KIF5A逆转了TMT处理造成的蛋白变化。

文献二

WDR45通过调控内质网稳态和神经元死亡参与神经退行性病变

WDR45 contributes to neurodegeneration through regulation of ER homeostasis and neuronal death

期刊：Autophagy

影响因子：16.016 PMID:31204559

β螺旋桨蛋白相关神经退行性疾病（BPAN）是一类脑组织铁沉积相关的神经退行性疾病。表现为儿童期的运动和认知功能发育迟缓、智力残疾，并一直延续到成年。外显子测序发现了WDR45突变，但WDR45丧失如何导致BPAN的神经变性的机制仍不清楚。本研究利用CRISPR-Cas9技术构建了WDR45敲除小鼠，以期在该模型基础上研究WDR45基因的致病机理。

为了验证WDR45敲除是否成功，研究者分别用mRNA qRT-PCR和WB检测WDR45的mRNA和蛋白在实验组中的表达缺失。qRT-PCR明确了WDR45的显著缺失，但商业化的抗体无法在对照组和实验组检测到WDR45蛋白的表达，于是研究者利用PRM技术靶向检测了WDR45。PRM结果显示在实验组中，WDR45的两条特异性肽段都显著缺失，明确了WDR45蛋白的缺失。综合mRNA qRT-PCR和蛋白的PRM靶向检测证明了研究者对WDR45敲除的成功。因此，PRM是很好的进行靶向蛋白质检测的技术，研究者可以根据实验的具体情况灵活选择蛋白检测或者验证的技术。

吉凯基因提供PRM、4D-PRM蛋白质组服务，助力科研工作者更好地进行蛋白相关研究。PRM产品报价和周期，请微信添加吉凯“jikaikefu”进行咨询。

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·蛋白质组学平台拥有多台timsTOF Pro、Exploris 480高精度质谱仪，专业领先的Spectronaut Plusar、Mascot等分析软件，提供专业的4D、DIA、TMT、PRM、磷酸化修饰组、olink蛋白质组等检测服务，强大的机器学习算法、IPA分析、蛋白基因组分析服务，系统的生物标志物、分子分型、药物靶点、基因功能研究等解决方案，真正让广大研究型医生的科研工作更省心、更省力、更高效；

·高通量测序平台分为常规测序服务和单细胞测序服务：单细胞测序拥有10x和BD两个平台，提供单细胞RNA-seq、单细胞核测序、单细胞混样RNA-seq、单细胞TCR/BCR、单细胞（RNA+ATAC）、空间转录组测序等服务；常规测序服务提供meRIP-seq（m6A/m1A/m7G/m5C 等RNA甲基化修饰测序）、acRIP-seq（ac4C RNA乙酰化修饰测序）、ATAC-seq、Ribo-seq（翻译组测序）、mRNA/miRNA/LncRNA/circRNA-seq、全转录组测序（两文库/三文库）、外泌体miRNA/LncRNA-seq、WGS/WES、WGBS、RRBS、BSAS等服务。