酶标仪是高通量筛选的必备仪器之一，凡是与光信号相关的实验、需要节省试剂且可以转移到微孔板中的实验，都可以考虑使用酶标仪进行信号检测。除了大家熟知的 ELISA、MTT 等应用以外，通过选择合适的标记物，酶标仪还可以用来检测大分子之间、大小分子之间的相互作用。当分子间满足相互作用条件（距离、光谱等）时，通过捕捉标记物之间“一点通”的光信号，即可快速准确的判断结合情况。
接下来，美谷博士就带大家看一下酶标仪上分子间相互作用的检测原理及应用实例。
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荧光共振能量转移（Förster resonance energy transfer, Fluorescence resonance energy transfer, FRET)
原 理
FRET 是指在两个不同的荧光基团中，如果供体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定的重叠，供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光，同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减。FRET 程度与供、受体分子的空间距离紧密相关， 一般为 7～10 nm 时即可发生 FRET 。 随着距离延长， FRET 呈显著减弱。
FRET 可应用于生物大分子间的相互研究，如受体-配体、蛋白-蛋白、蛋白构象改变等的相互作用研究。
FRET 主流的荧光探针主要有三种：荧光蛋白、传统有机分子和镧系元素。
常用配对包括 EDANS/DABcyl、MCA/DNP、BFP-eGFP 及 CFP-YFP 等。
注解：A、B 为两个生物大分子，分别与供体 CFP 和受体 YFP 相连，通过供体-受体的 FRET 信号，可以得知 A 与 B 是否存在相互作用。
应用举例
离子通道研究：电压敏感探针 Voltage Sensor Probes（VSP）是一种基于 FRET 的染料系统，用于测量细胞膜电位的变化。FRET 供体香豆素-磷脂（Coumarin-phospholipid，CC2-DMPE）只结合在细胞膜外侧。FRET 受体是可移动的、带负电荷的疏水性类菁染料化合物染料（Oxonol），根据膜电位变化结合在细胞膜的一侧。静息状态下细胞膜电位内负外正，受体在细胞膜外侧，能够与供体产生 FRET 信号。而离子通道打开，细胞去极化时，供体仍保留在外膜上，而可移动的受体则快速转位至细胞膜内表面，从而导致 FRET 信号减少，由此可以判断膜电位是否发生变化。
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时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
原 理
传统荧光染料最大弊端是荧光寿命短，易受到样品自发荧光干扰。而使用镧系元素标记，有着长荧光寿命周期。当其被闪烁氙灯激发后，其发射光维持的时间要比普通荧光素长很多，因此可以在激发光和自发荧光干扰消失后，再进行信号的检测，具有灵敏度高、标记稳定、线性范围宽等优势。将 FRET 的供体改为镧系元素，当激发受体时，后者发光时间也会比较长，因此比一般 FRET 信号更强，检测更灵敏。
注释：镧系元素发射光（橘黄色曲线）维持时间要长于普通荧光染料（绿色曲线）
HTRF 使用 4 种专门的荧光基团，能够组合成一对供体-受体 TR-FRET 基团。供体为铕（Eu3+）的穴状化合物和铽（Lumi4-Tb）的穴状化合物，两种受体分别为 XL665 和 d2。这两种受体的激发光谱均与 HTRF 供体的发射光谱重叠，每个受体的发射峰都在 665nm，且供体在这一范围内没有发射光或发射光很弱。最初的 HTRF 受体 XL665 ，是一种从红藻中纯化出的藻胆蛋白色素。第二代受体 d2 是一种经过修饰的别藻蓝蛋白，比 XL665 小 100 倍且可以减少可能在 XL665 检测中出现的空间位阻问题。
应用举例
cAMP（Cyclic adenosine 3’, 5’–monophosphate）检测 HTRF cAMP HiRange 试剂盒可对细胞样品中的 cAMP 进行定量，cAMP 是 G 蛋白偶联受体（GPCR）信号传导中的关键第二信使。配体与 GPCR 结合后，会发生构象变化，激活受体，进而激活 G 蛋白。进一步的信号转导取决于激活的 G 蛋白的类型。Gs 蛋白的活化导致腺苷酸环化酶对 cAMP 的上调。细胞产生的游离 cAMP 与 d2 标记的 cAMP 竞争结合抗 cAMP 穴状化合物，因此细胞 cAMP 的增加导致 FRET 的减少，这可以通过 665 nm 发射的荧光减少来检测（下图）。
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生物发光共振能量转移技术（Bioluminescence resonance energy transfer, BRET）
原 理
BRET 与 FRET 相比，供体采用萤光素酶生物发光，不再需要激发光，因为没有样品自发光干扰，所以背景更低，信噪比更高。
右图注释：Protein X 和 Y 分别与供体和受体相连，当 XY 之间没有相互作用时，距离较远，无法产生 FRET 信号；而当 XY 之间有相互作用时，由于距离靠近，使得供体和受体之间发生 FRET ，可以检测到受体的发射光信号。
应用举例
检测 p53-MDM2 蛋白相互作用：来自于 Promega 的 Nano BRET 技术，利用了 NanoLuc 荧光素酶作为 BRET 检测供体分子，标记有 HaloTag 荧光基团的蛋白发射 618 nm 荧光波长作为受体分子。
注释：当 NanoLuc- Protein A 融合体 ( 能量供体 ) 与荧光标记的 HaloTag-Protein B 融合体 ( 能量受体 ) 相互作用时，供体和受体会距离更近，能量发生转移。
以 NanoBRE PPI 质控对 p53 和 MDM2 为例，二者配偶使得能量供体和受体之间距离靠近，加入 Nano-Glo 底物溶液后，发生 BRET 现象，在酶标仪上测量供体发射光（447 nm）和受体发射光（610 nm）。使用 p53 途径激活剂 nutlin-3 以浓度依赖性方式破坏 p53 与 MDM2 的相互作用后，则 BRET 信号降低。
注释：nutlin-3 对 p53-MDM2 相互作用的破坏，信号值随 nutlin-3 浓度增加而降低。
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荧光偏振 （Fluorescence Polarization ，FP ）
原 理
当荧光分子受平面偏振光激发时，如果分子在受激发时期保持静止，发射光将位于同样的偏振平面。如果在受激发时期，分子旋转或翻转偏离这一平面，发射光将位于与激发光不同的偏振面，这一现象称为荧光去偏振。FP 用于检测溶液中生物大分子与小分子之间的相互作用，大、小分子未结合时，荧光标记的小分子运动速度快，发射光去偏振化，检测到低的毫偏振值（mP）；而当荧光标记的小分子与生物大分子结合后，旋转变慢，发射光保持偏振性，检测到高的毫偏振值（mP），mP 值的高低与分子相互结合的效率成正比。
常见的荧光标记染料分子包括异硫氰酸荧光素 FITC 、四乙基罗丹明 RB200 、四甲基异硫氰酸罗丹明 TRITC 等。
应用举例
激酶检测：磷酸化和去磷酸化是蛋白的修饰过程，蛋白通过加上或脱去磷酸基团而获得或失去了活性。IMAP技术基于固定金属离子亲和技术，不需要抗体，而替代以一种极微小粒子，该粒子表面包被三价金属阳离子，标记物借助于固定在微小粒子表面的三价金属阳离子与第五的磷酸基团结合，从而引起极化值的变化。
注释：在激酶与荧光标记多肽反应后，加入结合溶液。小分子磷酸化荧光底物会结合到大分子 M（III）纳米微粒上，由此可降低底物的旋转速度并因此增加其偏振性。
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放大的化学发光亲和均相检测（Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay Screen，ALPHAScreen）
该技术是基于微珠的均相亲和检测方法。ALPHA 技术需要两个由不同的化学混合物组成的微珠，分别为供体微珠（供体 beads）和受体微珠（受体 beads）。供体珠包含光敏剂苯二甲蓝，680nm 激发光照射下，它将周围环境中的氧分子转化成为一种高能活跃的氧状态-单体氧（Singlet Oxygen）。供体微珠每秒能够产生 60000 个左右的单体氧分子，4us 的半衰期内，单氧分子可在溶液中扩散高达 200nm 的距离，在此范围内若存在受体微珠，单氧就会触发受体微珠的二甲基噻吩衍生物，继而激发一系列的化学反应，并在 520-620nm 产生光信号，达到检测目的。
AlphaScreen 和 AlphaLISA 都使用同一种供体微珠，但使用不同的受体微珠：
Alphascreen 受体微珠：二甲基噻吩、蒽、红荧烯（最终发光染料）
AlphaLISA 受体微珠：二甲基噻吩、Eu螯合物
应用举例
蛋白激酶检测：激酶有活性的情况下，底物被磷酸化，拉近了供体和受体的距离，产生光信号。
总结
当检测大小分子相互作用（例如多肽与蛋白）时，可以通过在小分子上标记荧光探针，用荧光偏振的方法进行实验。当检测两个分子量相差不大的大分子之间的相互作用时，可以通过选择合适的供体-受体对，虽然供体-受体不能直接结合，但是当距离合适，且光谱符合特定条件时，依然可以“心有灵犀一点通”，通过能量转移的方式进行测量。如果您对某个检测方法感兴趣，欢迎联系我们，获得更详细的操作信息。
关于美谷分子仪器
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