BD Rhapsody单细胞多组学技术，可同时实现单细胞的转录组+蛋白组+VDJ分析+混样技术。在即将分享的Nature工作中，作者充分利用BD的多组学优势，开创性的发现了肿瘤特异Treg细胞并鉴定了其生物标志物，为未来肿瘤靶向治疗提供可能。
此外，该工作大量使用BD流式分析技术及BD Rhapsody单细胞多组学技术，实验结果互相验证，相辅相成；单细胞RNA测序样本，全部利用BD流式分选技术进行样本富集，提升单细胞数据分析精度，同时节约测序成本。BD流式技术与BD Rhapsody单细胞多组学技术珠联璧合，为单细胞研究提供多维度的解决方案，欢迎广大科研临床及工业用户试用！
今天要和大家分享的文章，是近期发表于Nature期刊的 “Extricating human tumour immune alterations from tissue inflammation” ，该工作系统性的分析了头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）及部位匹配的非恶性炎症口腔粘膜（OM）的免疫特征，发现了一群肿瘤特异的Treg亚群，具有显著的免疫抑制，可应答TCR信号，且可活跃增殖；并创新性的鉴定了其生物标志物，为肿瘤精准治疗提供新的思路。
背景
免疫疗法在癌症治疗方面取得了显著的成功，但仍然存在挑战。其中一个显著弱点就是，治疗所靶向的通路并不局限于肿瘤，在其他组织微环境中也存在。尽管很多工作聚焦在肿瘤微环境的炎症反应，但是我们对肿瘤特异的免疫变化还知之甚少。
方法
单细胞RNA测序技术：
BD Rhapsody单细胞多组学平台：
BD Abseq（人）免疫检测组合（#625970）
样品标记抗体试剂盒（#633781）
BD Abseq寡核苷酸偶联抗体
633750 Rhapsody检测人免疫响应相关基因表达的引物
流式分析OM及HNSCC及外周血的
免疫表型：
流式分析：BD SymphonyA5
流式分选：
BD FACSAriaIII（20 detectors and 405 nm, 488 nm, 532 nm and 628 nm lasers）
BD FACSSymphony S6 cell sortor（50 detectors and 355 nm, 405 nm, 488 nm, 532 nm and 628 nm lasers）
实验结果
1
OM和HNSCC的免疫表型趋于一致
肿瘤组织中，功能衰竭的T细胞和Treg细胞，通常被认为是抗肿瘤免疫反应无效的关键。另外，T细胞的效应功能与APCs（Antigen Presenting Cells）密切相关。作者通过2组30参数的高维流式panel深度分析了OM和HNSCC组织及血液中的上述免疫细胞图谱。结果发现在OM和HNSCC组织的免疫表型基本相似：CD45+ Live细胞中CD3+ T细胞，CD19+ B细胞以及CD56+ NK细胞的比例以及CD4/CD8 ratio基本一致（Fig 1a）。APC细胞方面，cDC2s，DC3及CD16+非常规单核细胞的比例在OM及HNSCC组织中基本一致，CD141+ cDC1s比例在HNSCC肿瘤组织中的略低（Fig 1b）。
为了鉴定特定的免疫亚群的差别，作者利用了FAUST，一种以无监督的方式发现和注释统计上相关的细胞表型的机器算法。结果发现，T细胞panel中，HNSCC中富集一个CD8+ T和4个CD4+ Treg 亚群；APC细胞panel中，HNSCC中富集CD40及PD-L1共表达的CD14+细胞及cDC2s，DC3细胞。
Figure 1. 流式分析炎症性非恶性OM组织与HNSCC的免疫表型
2
分析肿瘤富集的APC与T细胞之间的细胞通讯
为了进一步研究上述免疫细胞的一致性及区别，作者利用了单细胞RNA测序技术，发现了与上述流式结果相一致的免疫表型，并鉴定了肿瘤特异的转录特征。之后通过NicheNet方法研究了肿瘤特异性的T细胞和APC细胞通讯。发现HNSCC肿瘤T-APC细胞通讯富集的配体受体相互作用如下：ICOS配体via ICOS，IL-18 via IL18-R1以及IL1B via IL-1受体1型及2型。
由于流式及scRAN-seq都显示HNSCC肿瘤Tregs细胞的差异，接下来作者进一步验证Treg-APC的相互作用。通过流式分析发现IL1R1（富集于T细胞与APC通讯）特异性的表达在肿瘤浸润的Treg细胞上（Figure 2a）。几乎所有的IL1R1+ T细胞共表达ICOS，IL-18R1以及趋化因子受体CXCR6（Figure 2b）。
Figure2. 流式鉴定肿瘤浸润的Treg的免疫表型
3
IL1R1+ Treg 细胞的单细胞转录组特征分析
为了进一步区分肿瘤浸润的IL1R1+ Treg 及IL1R1- Treg 细胞的区别，作者分选了OM、HNSCC以及外周血中的Treg细胞，利用了BD Rhapsody免疫响应基因panel的单细胞RNA测序，发现肿瘤IL1R1+ Treg（Figure 3a，橙色亚群）及IL1R1- Treg（Figure 3a，蓝色亚群）细胞形成了独立的亚群，区别于外周血Treg细胞。在IL1R1+ Treg 细胞中，选择性的富集了≥50个转录本（Figure 3b），包括TNFRSF18（编码GITR）和TNFRSF9（编码4-1BB），提示IL1R1+ Treg 细胞代表肿瘤浸润Treg细胞中一群转录组特异的免疫亚群。
Figure3. BD Rhapsody靶向单细胞RNA测序分析IL1R1+ Treg转录组特征
4
IL1R1+ Treg 细胞高度抑制性的功能研究
在CD8+ T细胞及CD4+ T细胞的体外增殖抑制实验中，IL1R1+ Treg 细胞比IL1R1- Treg 细胞具有更有效的抑制效果（Figure 4a）。另外，通过anti-CD3, anti-CD28 and anti-CD2 磁珠刺激，肿瘤浸润IL1R1+ Treg 中IL1R1的表达在第1天升高，第2-3天下降（Figure 4b），提示IL1R1+ Treg 细胞应答TCR信号并产生IL1R1的表达。
Figure 4. IL1R1+ Treg 细胞功能研究
为了进一步研究肿瘤浸润IL1R1+ Treg 细胞应答激活信号的免疫反应，作者利用PMA及离子霉素短时间刺激，然后利用BD Rhapsody单细胞转录组联合Abseq膜蛋白测序，系统性的分析了这类细胞的转录组、蛋白组变化。对CD4+ T细胞及Treg细胞进行无监督聚类分析，显示3个Treg亚群：IL1R1-，IL1R1+及活跃增值的IL1R1+ Treg 细胞。PMA及离子霉素刺激后，Treg细胞差异表达蛋白及差异表达基因见Figure 5a-b，例如高表达TNFRSF9 及CTLA4 转录本，并显著高表达CTLA4蛋白，提示IL1R1+ Treg细胞是激活并具有功能，且有一个活跃增殖的亚群。
Figure 5. BD Rhapsody单细胞多组学分析Treg细胞激活应答免疫反应
通过Abseq单细胞膜蛋白结果，作者鉴定出了一组生物标记物来唯一地识别IL1R1+ Treg细胞。仅用2个膜表面蛋白就可以特征的从组织和外周血所有CD45+的免疫细胞中标记这类细胞，并通过流式分析验证了标志物的特异性：几乎所有的CD45+IL1R1+ICOS+细胞都是Treg细胞（Figure 6a），为未来靶向肿瘤特异性Treg细胞的治疗提供新的思路。
Figure 6. 发现并验证肿瘤特异Treg的生物标志物。
最后作者通过实验验证及公开的scRNA-seq数据集（19种不同的肿瘤类型）分析发现，IL1R1+ Treg细胞并不是特异性的存在于HNSCC肿瘤，而是不同比例的分布于不同的实体肿瘤中。清除肿瘤浸润性Treg细胞被认为是一种有前景的抗肿瘤治疗，该工作为靶向肿瘤特异Treg而不影响其他Treg免疫调节功能提供了可能。
单细胞多组学平台
BD Rhapsody™
BD Rhapsody™ 单细胞多组学分析系统能够对成千上万个单细胞的蛋白与基因进行数字定量，提供灵活的定制化Panel及标准化应用方案，以满足不同的实验需求，其独特的混样技术可有效节约时间与成本。
系统组成包括：
BD Rhapsody™ 扫描仪
BD Rhapsody™ 上样台
BD Rhapsody™ cartridge（微孔板）
分子标签试剂和文库制备
全转录组检测试剂盒/靶向RNA检测试剂盒/定制试剂盒
Abseq蛋白检测试剂盒
多样本混样检测试剂盒
VDJ检测试剂盒
单细胞测序数据分析软件BD SeqGeq
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