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在上一期Taq Talk中，我们了解了如何分析qPCR SNP基因分型数据。在本周第二十期课程中，我们来学习SYBR Green熔解曲线的相关知识。
SYBR™ Green扩增曲线的形状无法用于特异性评估。不论扩增的是靶点、非靶点还是混合物，曲线外观几乎相同。不同样本之间的非靶点扩增有所差别，每个SYBR™ Green反应都应完成至少一种类型的特异性评估。最常用的评估是熔解曲线分析。
熔解曲线分析
实时荧光定量PCR分析的特异性取决于使用的引物及反应条件。但即便是设计极佳的引物亦可能形成引物二聚体或扩增出非特异性产物。当包含基因组DNA的RNA样本进行qRT-PCR时，基因组DNA也有可能被扩增。可采用熔解曲线分析确认实时荧光定量PCR反应的特异性。
图1 熔解曲线分析可用于检测是否存在非特异性产物 (如引物二聚体)，如图所示，熔解曲线中扩增产物峰的左侧有其它的峰。
熔解曲线图
随着反应温度的升高，当结合染料分子的双链DNA (dsDNA) 解离或“熔解”成单链DNA (ssDNA)时，可以从溶解曲线图上观察到荧光强度的变化。例如，当加热结合有SYBR™ Green I染料的双链DNA时，其达到熔点 (Tm) 后，由于DNA链的解离和染料的释放，检测的荧光强度会出现突然下降。绘制荧光强度与温度图，及-ΔF/ΔT(荧光变化/温度变化) 与温度图，清晰显示熔解曲线动态范围。
图 2. 熔解曲线 (A) 和 -ΔF/ΔT 与温度 (B)。
扩增后熔解曲线分析是一种简单、直接地检查实时荧光定量PCR反应中引物二聚体结构的方法，可确保反应的特异性。由于核酸的熔解温度受长度、GC含量以及是否存在碱基错配等因素影响，不同的PCR产物通常可根据其熔解特性区分。通过熔解曲线分析鉴定反应产物 (如引物二聚体与扩增片段) 省去了耗时的凝胶电泳步骤。
如何进行熔解曲线分析
要进行熔解曲线分析，应对实时荧光定量PCR仪进行编程，在热循环实验方案结束后显示熔解曲线。扩增完成后，仪器将重新加热您的扩增产物，为您提供完整的熔解曲线数据。大多数实时荧光定量PCR仪平台已将该特性整合至其分析软件包内。
图3 Applied Biosystems™ 仪器上的熔解曲线热学特性设置示例 (快速加热至94°C，变性DNA，然后冷却至60°C)。
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