质粒，小型环状DNA分子，作为常用载体，可以直接被应用于人体，例如DNA/mRNA疫苗、基因治疗、CAR-T，也可以用于对细胞的基因工程改造生产重组蛋白等生物医药产品（图1）。全球细胞和基因治疗市场的持续火热及新冠疫情的变化导致质粒DNA需求日益增长，因此在工艺开发的早期就需要优化工艺，来满足未来治疗药物生产所需的数量和质量要求。
图1. 质粒应用场景
质粒DNA的生产过程主要包括质粒DNA的构建、发酵生产、菌体收获、菌体裂解，上清液收集、纯化浓缩和过滤分装（图2）。通常发酵规模为30-200L，由于其大尺寸、高负电荷、剪切敏感性、高粘度以及与生产过程中杂质之间的相似性（开环DNA、基因组DNA、高分子量RNA），每一步的单元操作都面临不同的挑战。例如裂解菌体的过程中要注意碱处理和搅拌剪切力对质粒完整性的影响，澄清过程中需要选择合适的滤器降低质粒DNA的吸附，超螺旋质粒DNA作为治疗和转染的理想形式，需要一个良好优化的下游工艺来保证其高收率和高纯度。
图2. 质粒生产工艺流程
澄清后的裂解液成分复杂，杂质含量高达97%，通常使用阴离子交换层析和疏水层析，用于捕获或中间纯化/精纯，并且经常结合使用。当使用AEX作为质粒DNA的捕获步骤时，可用于去除大部分宿主细胞蛋白、RNA和内毒素（图3）。上样前在裂解液中添加一定量（eg.120-250mM）的NaCl，可消除RNA的干扰，从而提高质粒DNA的结合能力。添加的盐浓度需要通过前期小试工艺摸索确定，测量不同盐浓度时的质粒DNA的结合能力。另外在洗涤（wash）和洗脱（elution）步骤中添加一定浓度的表面活性剂（eg. 0.5% detergent）和EDTA（eg.2mM）可有效降低内毒素水平。
图3. 阴离子交换层析捕获质粒
传统的阴离子填料孔径较小，依赖于较缓慢的扩散流和较长的停留时间，以便分子接触到位于孔隙内的结合基团，限制了对更大目标分子捕获的能力，如质粒DNA。质粒比蛋白质大得多，不能进入填料小孔，传质较慢，导致结合能力较低（1-3mg pDNA/mL），同时由于料液的粘性，上样速度较慢，增加了纯化压力，通常需要安装过大的层析柱来满足工艺时间的要求。
Natrix® Q膜层析有着独特的功能化大孔水凝胶结构（图4），极高的膜面积和较高的结合基团密度使其具备极高的流速和较短的停留时间，对流孔径的设计可以有效促进传质，提高结合能力（5-10mg pDNA/mL），流速可高达10MV/min，无需浓缩直接上样，30分钟即可高效完成质粒DNA纯化，而传统填料需要240分钟完成纯化（图5）。基于高流速和高结合能力的整合，Natrix® Q膜装置的规格将远小于同等效力的层析填料柱。
图4. Natrix® Q膜层析与传统层析填料结构对比
图5. Natrix® Q膜层析与阴离子填料纯化质粒时间对比
Natrix® Q膜层析作为一种新型技术，突破载量和流速的限制，满足快速捕获质粒的要求（图6）,增强生产过程的灵活性和耐用性，并且该一次性使用技术具有提高生产效率，降低成本的优势（图7）。
图 6. (a) Natrix® Q捕获质粒DNA的层析图谱；(b) 洗脱液的分析型 HPLC 色谱图，ccc-form共价闭合环状质粒DNA，oc-form开环质粒DNA
图 7. 规模化生产效率对比：Natrix® Q 膜层析 vs. 填料
Natrix® Q膜层析产品规格齐全（图 8），可适配从小试工艺开发，临床批次样品制备，到商业化生产的不同规模批次的需求，Recon Mini可通过鲁尔接头连接至层析系统，完成层析条件摸索。质粒性质稳定，制备后可分装冻存，用于后续病毒载体制备，mRNA转录等需求。Natrix® Q膜层析无需装柱，即插即用，配套设备更小更灵活，一次性使用，无需清洁验证，非常适合质粒单批次规模化制备。
图 8. Natrix® Q膜层析产品系列
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