病毒载体，是指利用基因工程技术对病毒进行改造，成为外源基因运送的载体，其通过感染细胞，将外源基因带入细胞，进行基因表达。目前，病毒载体作为常用的递送系统，用于基因修饰细胞疗法，如CAR-T、TCR-T，溶瘤病毒治疗以及基因递送疗法等。其中，常见的病毒载体有腺相关病毒AAV（Adeno-associated Virus）、慢病毒LV（Lentivirus）、腺病毒Adv（Adenovirus）等，是目前在研CGT项目采用最多的病毒载体类型。接下来，针对病毒载体收获三步工艺，核酸酶消化、澄清、切向流过滤，来了解一下病毒载体收获澄清工艺的考量和解决方案。
核酸酶消化
病毒载体的培养过程中会产生大大小小的核酸片段，这不仅增加了料液的粘度，也给澄清带来了挑战。在料液中添加一定量的核酸酶，降低核酸片段的大小，以减轻下游过滤器的压力，是很多工艺开发人员的首选。核酸酶的表现是开发人员最关注的问题，不仅要考虑消化后的核酸片段的大小，还要考虑核酸酶是否稳定、表现是否一致。默克Benzonase®核酸酶可以高效消化核酸片段，显著提升澄清过滤器的载量和性能，有利于后续切向流过滤的浓缩效率，极大程度上降低超滤后料液的DNA含量，如图1所示。一个单位的Benzonase®核酸酶可以在30分钟内降解约37μg的DNA至3-8个碱基对（<6kDa）。
图1. 加入核酸酶与否，超滤工艺浊度和压力表现对比
AAV收获澄清
AAV作为最常用的病毒载体，与LV不同的是，AAV在培养过程中大多是胞内分泌，因此需要加入表面活性剂去裂解细胞。细胞裂解液通常核酸碎片和细胞碎片多，料液粘度高，这对深层过滤是个挑战。此外，病毒载体在常规的收获环境中带负电，更容易被带有正电的过滤介质吸附，从而导致收率损失。因此，在AAV的澄清工艺中，过滤材质吸附和材质孔径范围是两个选择深层过滤器的主要考量因素。
AAV收获澄清影响因素—材质吸附
为了研究材质吸附对收率的影响，我们从澄清透过端取样检测AAV的浓度。随着上样量的增加，如果透过端的AAV浓度变化明显，则表明过滤介质存在一定吸附作用。如图2所示，20MS和D0SP过滤器未观察到明显吸附，而X0HC透过端病毒浓度变化明显，可能存在一定吸附。
图2. AAV收率与澄清膜包介质的关系
AAV收获澄清的影响因素—材质孔径范围
随着材质孔径范围的增大，病毒收率也逐渐提高，如图3所示。但孔径范围增大意味着杂质碎片也更容易透过澄清介质，浊度上升。在选择过滤器时，需要考量孔径范围去平衡收率和浊度。
图3. AAV2收率与孔径范围的关系
因此，在AAV澄清工艺步骤中，综合考虑材质吸附和材质孔径范围的影响，选择合适的深层过滤器，使其在保证病毒回收的同时，对细胞裂解液有良好的澄清效果，且载量的表现使人满意，来提高下游工艺的效率。
AAV收获澄清的解决方案
为了选择合适的深层过滤器，默克对国内外的50多项评估测试进行了数据分析，Clarisolve® 20MS和Millistak+® HC Pro D0SP的表现脱颖而出。如表1所示，20MS和D0SP表现出了高载量（> 250 L/m2）、平均收率高（> 70%）的特点，保护了下游的除菌过滤器，在多种血清型之间呈现了一致的结果。
表1. 各深层过滤器在AAV澄清上的平均性能表现
由于目前病毒载体工艺的规模主要还是以200L为主，因此在选择深层过滤器时，病毒回收率是重要的考量因素。D0SP和20MS与市面上其他澄清过滤器的性能表现相比，同样也具有优势（图4），综合载量和收率考量，是AAV澄清工艺的解决方案。
此外，默克在针对悬浮培养的LV收获澄清工艺上也有相应的解决方案。Clarisolve® 60HX是LV单级澄清的一个解决方案，它可以达到65 L/m² 的平均载量，浊度降至约 24NTU；而Millistak+® CE35和Milligard® PES膜过滤器的两级澄清方案也是LV收获澄清不错的选择。
图4. 不同供应商的深层过滤器在AAV澄清上的性能比较
切向流过滤
在病毒载体工艺中，进行第一步超滤浓缩，置换缓冲液，来满足下游纯化工艺的条件。此外，之前加入的核酸酶和表面活性剂在这一步超滤被部分去除。我们在选择超滤膜包孔径时，需要考虑收率和除杂之间的平衡。
根据3-5倍经验法则和病毒载体大小，一般会选择100kD或300kD的膜孔径，如表4所示。
表4. AAV和LV超滤工艺的理论膜孔径
实验证明，100kD和300kD的Pellicon®系列膜包对AAV 有较高的截留率，能有效减少损失，如图5所示。
图5. Pellicon®系列超滤膜包的AAV截留表现
超滤工艺对核酸酶和表面活性剂有不错的去除效果。我们使用了300kD的膜包，5倍透析后即可以达到>99.5%的核酸酶去除率，8倍透析后可以达到>99.9%去除率，见图6。而针对AAV特有的表面活性剂去除，由于加入表面活性剂可能会产生3.5-4.5 nm的胶束，因此，300kD的超滤膜包更有利于表面活性剂的去除。膜孔径的选择还需要根据料液的实际状况具体分析。
图6. 超滤膜包在核酸酶去除上的表现
在病毒载体收获澄清的超滤工艺中，Pellicon® 2 100kD或300kD C筛网和Pellicon® Capsule一次性超滤膜包是不错的选择。Pellicon®系列膜包具有高通量的特点，坚固可靠，耐受高操作压力，多种筛网供选择，实现工艺最优化。Pellicon® Capsule一次性超滤膜包，即插即用，易于安装，已经过伽马灭菌，无需预处理步骤。
总结
综合上述理论和数据，在病毒载体收获澄清三步工艺中，默克的核酸酶、深层过滤器和超滤膜包都能具有良好的性能表现，可以满足从小试到生产不同规模的使用。Benzonase®核酸酶降低核酸片段大小，提高澄清和TFF效率；Clarisolve®和Millistak+®系列深层过滤器具有低吸附和高回收率的表现，是病毒载体收获澄清的首选；Pellicon®的坚固耐用性能、杂质清除能力和多筛网选择，是经典通用的超滤解决方案。
另外，默克还提供了VirusExpress® HEK293和GMP级别的Sf-RVN®细胞株，以及配套的Cellvento®和EX-CELL®细胞培养基，还有密闭系统应用于病毒载体工艺。
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参考资料：
Adams, Benjamin, et al. “Moving from the Bench towards a Large Scale, Industrial Platform Process for Adeno‐Associated Viral Vector Purification.” Biotechnology and Bioengineering, vol. 117, no. 10, 9 July 2020, pp. 3199–3211, 10.1002/bit.27472. Accessed 14 Nov. 2021.
Grieger, Joshua C, et al. “Production and Characterization of Adeno-Associated Viral Vectors.” Nature Protocols, vol. 1, no. 3, Aug. 2006, pp. 1412–1428, 10.1038/nprot.2006.207.
Krishnan, Ratish, and Matthew Roach. “Midstream Unit Operations: Unsung Heroes in AAV Process Development.” Cell and Gene Therapy Insights, vol. 7, no. 10, 10 Nov. 2021, pp. 1309–1321, 10.18609/cgti.2021.173. Accessed 23 Feb. 2022.
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