细胞培养工艺|Cu离子对细胞生长和产品质量的影响

默克工艺解决方案

2016.11.21

作者默克

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Cu离子对细胞生长和产品质量的影响

铜离子对细胞培养具有两面性。一方面，铜离子参与了多种代谢通路中关键酶反应，是细胞生长所必须的微量元素。另一方面，铜的氧化还原特性会产生自由基，诱导细胞氧化损伤。细胞培养过程中需要平衡细胞对铜离子的需求和高剂量铜的潜在毒性，需要优化CD培养基的铜离子浓度。

以前研究报道高浓度的铜离子介导细胞从乳酸生产途径转换成乳酸消耗途径，但引起代谢转换作用机制并不清楚。本文针对不同浓度的铜离子对不同细胞株生长、抗体分泌以及抗体质量的影响进行分析。

Cu离子：

Cu离子拥有两面性，一面，铜离子参与了多种代谢通路中关键酶反应；一面，铜的氧化还原特性会产生自由基，诱导细胞氧化损伤。在大家眼里：讲实话，Cu离子是怎样的Cu离子我自己都不清楚...

实验一

测试细胞系1不同铜离子浓度的培养基中的反应，实验方案见表1和表2

对细胞生长和抗体表达的影响

根据图1和图2中细胞的生长和抗体表达状态，将8组不同条件的细胞分成三种类型，高密度、高活率、高产量、乳酸消耗和乳酸终浓度低的细胞为类型A；较高密度、较高活率、较高产量、乳酸生成、乳酸终浓度较高的细胞为类型B；低密度、低活率、低产量、乳酸生成和乳酸终浓度高的细胞为类型C。类型C为典型的铜离子缺乏的细胞状态，活率最先开始降低、生长和分泌最早进入平台期，并且乳酸的积累导致生长抑制。

细胞对铜离子的最小需求量

从图3和表3中可以看出，低铜离子浓度（0x，1x，1x+5xBolus）条件下，铜离子水平在第8天到第10天降到检测下限，但是由于细胞死亡引起细胞内铜离子释放，铜离子水平在第12天到第14天提高。在case1和case2条件下，胞外铜离子在第6天已经耗尽，第14天检测的铜离子浓度相当于最高密度的细胞在整个培养过程中累积的铜离子量。由此推算细胞最小铜离子需求量为第14天检测的铜离子浓度除于最高PCV，数值约为30nM/%PCV。在case5-8条件下，由于每种条件的起始细胞接种一样，所有培养条件都包括case1条件的50nm铜离子，细胞最小铜离子需求量为最大铜离子消耗量与50nm铜离子总和除于最高PCV。当铜离子水平在60-220nm/%PCV时，细胞系1在不同条件下生长和分泌状态没有明显差别。而如果铜离子水平低于30nm/%PCV，则不利于细胞生长。

对抗体产品质量的影响

电荷异构体。从图4和图5可以看出，类型B中，中性峰比例较低，酸性峰比例在第14天达到最高值。类型A中，酸性峰比例变化趋势相似，碱性峰的比例随着胞外铜离子浓度的提高而增高。

糖型结构。类型A中具有高比例的G0型寡糖，但是G1,G1’和G2型寡糖比例较低，半乳糖基化在第7-14天发生明显的降低。类型B中，虽然在第14天具有较高比例的糖基化水平，半乳糖基化在第7-14天发生较明显的降低。类型C培养在第14天具有高比例的半乳糖基化水平，但其糖基化水平在第7-14天发生较明显的下降。类型C中，在第14天具有最高比例的糖基化水平。

不同条件的培养的纯度变化趋势类似，单体比例大于98.5%，聚合体比例小于1.0%，片段比例小于0.5%。

实验二

测试细胞株2和细胞株3在不同铜离子浓度的培养基中反应。实验方案见表1

为了探究不同浓度铜离子对细胞生长和抗体分泌及质量的影响是否适应于其他细胞株。细胞株2表达抗体Y和细胞株3表达抗体Z被用来进行评估。0X的铜离子浓度来验证是否铜离子缺乏会导致细胞生长受限效应。5-60X的铜离子浓度用来验证，高于阈值范围（30-60nm/%PCV）后，进一步提升铜离子浓度并不能带来细胞生长和分泌的提升。并且可同时用来探究铜离子浓度的提升和碱峰增加之间的关系。