典型的单抗通常由两条重链和两条轻链组成，一般在Fc片段CH2区域Asn297存在N-糖基化修饰，通过酰胺键与N-糖的非还原端N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）连接。N-糖基化修饰是单克隆抗体药物一种重要的翻译后修饰，约占翻译后修饰的50%以上，而且糖基化修饰形成的糖链虽然分子量只占整个单抗的3%，却发挥着重要的作用：能够维持抗体的空间构象、稳定抗体的结构，抗体脱糖基化后对热的稳定性会大大降低；能保护抗体不受某些蛋白酶的水解；糖链中特别的糖型还与免疫效应功能密切相关；同时一些特定的糖基化修饰类型以及不同的糖基化修饰程度都会影响抗体的安全性和有效性。因此，糖基化修饰是备受关注的关键质量属性。
典型的单抗结构（图片来源于网络）
糖基化修饰受细胞系、培养条件、纯化工艺等多因素的影响，如：CHO和BHK细胞表达的抗体分子、唾液酸和半乳糖的连接方式有差异；pH可能影响抗体半乳糖、岩藻糖、唾液酸等末端修饰；培养基中Cu2+单独使用可以降低单抗的岩藻糖和半乳糖修饰；Mn2+作为β-1,4-半乳糖苷转移酶的辅助因子，在一定范围内可以使单抗的半乳糖化和唾液酸化修饰增高等。由此可见，单抗药物的糖基化不是模式驱动过程，获得一致的糖型依赖于稳定的工艺和可靠的检测技术。
常见的N-糖糖型（图片来源于《中华肝脏病杂志》）
目前，国内外的相关指导原则均要求在产品特性分析中对糖型进行全面分析。丹纳赫生命科学旗下SCIEX的高分辨质谱拥有多种糖型检测模式。首先，可从完整蛋白的分子量水平分析抗体的糖修饰情况，完整蛋白水平分析可获得蛋白分子量信息以及不同糖型的相对含量，SCIEX 的OS软件集成了两百多种常见的N糖糖型，覆盖常见单抗及多数融合蛋白的N糖种类；其次，可精确检测酶切后Fc片段的分子量，从亚基分子量水平快速准确地鉴定亚基层面的糖基化修饰，还能获得如赖氨酸缺失、氧化等其他翻译后修饰的信息；然后，可从糖肽水平进行糖基化修饰类型和位点的确认，SCIEX的Zeno TOF™ 7600高分辨质谱系统拥有独特的EAD碎裂模式，可以提供N糖肽和O糖肽的完整序列覆盖信息，轻松发现并确认糖型和糖基化位点。
SCIEX Zeno TOF™ 7600高分辨质谱系统
在游离寡糖层面，通常有三种方法: 亲水相互作用色谱法（HILIC）、毛细管电泳法和高效阴离子色谱法。前处理通常是通过N-糖苷酶F对单抗N糖进行酶切后，使用2-氨基苯甲酰胺( 2-AB) 或2-氨基苯甲酸( 2-AA) 对寡糖进行标记，纯化后进行液相糖型分析。丹纳赫生命科学旗下的艾杰尔-飞诺美可提供完整的96孔板和萃取小柱与设备，用于标记后N糖纯化。艾杰尔-飞诺美的bioZen Glycan Clean UP采用创新的固相萃取（SPE）Hilic固定相，擅长保留和回收标记的N-糖链，能够高通量去除样品荧光试剂。艾杰尔-飞诺美的Cleanert Hilic固相萃取小柱，则具有良好的回收效果。
艾杰尔-飞诺美96孔SPE板的纯化步骤
另外，艾杰尔-飞诺美的bioZen Glycan色谱柱使用核-壳颗粒技术，使较短的色谱柱也能获得高柱效，其色谱柱上的酰胺多元醇固定对于中性、双触角聚糖和高度支化、唾液酸化聚糖都可以优化梯度和快速分离分析。
艾杰尔-飞诺美bioZen Glygan色谱柱分析糖型
由于游离寡糖标记时间通常较长，SCIEX开发了快速寡糖的前处理方法，通过磁珠获取酶切寡糖进行标记，纯化后再用毛细管电泳进行分离分析，整个前处理只需一个小时。SCIEX的毛细管电泳 PA 800 Plus制药分析系统的软件中内置了常用的单抗N糖糖型，分离结束后直接就可以分析得出结果。
SCIEX 的PA 800 Plus快速糖分析方法
最后还可以从单糖水平进行分析，使用外切糖苷酶阵列特异性地切断单糖之间的糖苷键，可获得单糖的连接顺序和连接位置的信息。SCIEX的PA 800 Plus由于可以准确控制样品室的温度，可以很好地完成酶反应，从而进行单糖水平的相关实验和分析。
SCIEX的PA 800 Plus 单糖分析流程
（Scientific Reports | 7: 11663 |
DOI:10.1038/s41598-017-11493-6）
丹纳赫生命科学多种不同的糖修饰分析方法，从单糖、寡糖、糖肽和完整蛋白的水平对糖进行全面分析，可以帮助科学家和药物开发者更深入理解糖基化的过程和影响，也有助于更好的控制糖基化修饰的过程。
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