在前3篇推文中，我们总结了主要的circRNA功能、研究方法和形成机制，接下来我们来研读下2022年发表在著名国际期刊Nature Biotechnology上的一篇文献Engineering circular RNA for enhanced protein production。
为了最大化 circRNA 翻译效率，研究人员主要考虑了5个要素：载体拓扑结构、5'' 和 3'' 非编码区、内部核糖体进入位点和合成招募翻译起始机制的核酸适配体。特别的，数据表明基于 锁核苷酸 (locked nucleic acids, LNA ) 的二级结构破坏可以消除或增强 circRNA 中的翻译起始。由于 IRES 驱动的翻译高度依赖于 RNA 结构，因此干扰RNA结构的反义寡核苷酸一定程度上可以调控IRES 。数据表明，靶向 circRNA 上eIF4G 结合位点的LNA 可抑制IRES 翻译。另一方面，锁定柔性区域构象的 LNA 可能通过调整不利二级结构的形成来促进 circRNA 翻译。我们的数据表明反义寡核苷酸可以在不同程度上控制 IRES 和 circRNA 功能。例如，如果 circRNA 正在产生不需要的蛋白质，则可以使用 LNA 轻松停止翻译。同时，数据也表明使用核酸适配体将 eIF4G 招募到 IRES 可以很容易地增强 circRNA 翻译。
在一系列体外实验基础上，研究人员测试了合成circRNA在小鼠体内的功能。实验人员首先通过腹膜内注射给小鼠注射编码 NanoLuc蛋白 的 circRNA。与未处理的动物相比，那些接受 circRNA 注射的小鼠在至少 1 周内表现出更高的发光活性（图 6c），表明工程化的 circRNA 可以在体内表达。当第一次注射后 2 周重新给药时，NanoLuc 表达水平也与第一次注射时持平，表明重复注射circRNA 应该是可行的。然后，该团队使用编码人促红细胞生成素 (hEPO)（一种用于治疗贫血的分泌蛋白）的 RNA，在体内对优化的 circRNA 与 CleanCap 和 100% N1Ψ 修饰的 mRNA 进行了头对头比较。与在 48 小时内迅速下降的 hEPO mRNA 表达相比，circRNA 表达在注射后至少 96 小时内保持稳定。在功能上，尽管需要比小鼠 EPO51 蛋白高得多的浓度，hEPO蛋白仍然 可以提高小鼠网织红细胞的数量。1 周后接受单剂量注射 hEPO 编码 circRNA 的小鼠的网织红细胞计数显着增加，而等摩尔剂量注射 mRNA 后的网织红细胞水平与未治疗动物没有差异。
总结
作者团队系统地剖析了控制 circRNA 翻译的五个功能元件：载体拓扑结构、5'' 和 3'' UTR、IRES 和核酸适配体。优化后，这些成分可将 circRNA 蛋白质产量提高数百倍，并能够在体内产生有效且持久的蛋白质。
从2022年12月开始，环状RNA系列推文从功能、研究方法、形成机制和具体应用共4个方面对 circRNA 研究做了梳理和总结，希望能帮助各位看官更好的理清和拓展思路，下期再会！
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参考文献：
Chen, R., Wang, S.K., Belk, J.A. et al. Engineering circular RNA for enhanced protein production. Nat Biotechnol 41, 262–272 (2023). https://doi.org/10.1038/s41587-022-01393-0
【环状RNA】序：功能一览
【环状RNA】上篇：研究方法指南
【环状RNA】中篇：合成和环化方法比较分析
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