甘薯是世界卫生组织推荐的最佳抗氧化、抗癌的保健食品，也是保障国家粮食安全的底线作物。此外，随着对天然类胡萝卜素需求的不断增加，植物类胡萝卜素在全球的学术和工业研究中引起了极大的兴趣。富含类胡萝卜素的橙色肉甘薯（马铃薯属）是生产天然类胡萝卜素的理想原料。因此，对于甘薯的种质资源研究非常有意义。然而，目前关于甘薯块茎根中类胡萝卜素代谢的分子机制的研究有限。
近日，山西农业大学贾小云教授领衔的薯类作物种质创新团队，在Biotechnology for Biofuels and Bioproducts（IF:7.670）发表了题为“Integrated metabolic and transcriptional analysis reveals the role of carotenoid cleavage dioxygenase 4 (IbCCD4) in carotenoid accumulation in sweetpotato tuberous roots”的研究论文。该研究探讨了3个不同薯肉颜色（白、黄、橘）的甘薯品种在不同发育阶段的类胡萝卜素种类、积累规律，发现了一组关键基因负责甘薯中类胡萝卜素的积累，其中IbCCD4发挥了关键作用。本研究为甘薯块根中类胡萝卜素代谢研究提供了新的思路，并暗示可以IbCCD4作为靶基因，用于开发类胡萝卜素高产的甘薯新品种。
文章标题：Integrated metabolic and transcriptional analysis reveals the role of carotenoid cleavage dioxygenase 4 (IbCCD4) in carotenoid accumulation in sweetpotato tuberous roots
期刊：Biotechnology for Biofuels and Bioproducts
影响因子：7.670
方法：酵母双杂交（由欧易生物提供技术支持）
图1. 甘薯类胡萝卜素积累机制研究思路
1.三个甘薯品种块茎根中类胡萝卜素的积累差异检测
对不同颜色的甘薯品种（图2-A），进行类胡萝卜素总量检测，发现总类胡萝卜素含量与甘薯块茎根的颜色表型密切相关（图2-B），通过质谱分析技术，对18个甘薯样品中的类胡萝卜素进行了定性和定量的代谢组学测定，共发现甘薯中有10种类胡萝卜素，且在甘薯块根不同发育阶段，不同甘薯间，类胡萝卜素种类含量存在动态差异变化（图3）。
图2. 3个甘薯品种的表型及总类胡萝卜素含量的动态分析
图3. 3个甘薯品种6个块根发育阶段中类胡萝卜素的定量分析
2.三个甘薯品种类胡萝卜素积累相关基因的表达量差异检测
为探讨3个品种块茎根中类胡萝卜素通路基因表达水平的差异，采用RT-qPCR方法分析10个类胡萝卜素生物合成基因（IbGGPS、IbPSY、IbPDS、IbZDS、IbCRTSIO、IbLCYB、IbLCHYB、IbCHYE、IbZEP）和3个类胡萝卜素分解代谢基因（IbCCD1、IbCCD4、IbNCED3）在甘薯块根不同发育时期的表达量（图4-B）。发现在XS18中，IbGGPS的IbPSY、IbZDS等多个类胡萝卜素生物合成基因的表达水平甚至高于SS8，尽管XS18的块根中只含有少量的类胡萝卜素。例如，在XS18中，在120 DAP时，IbPSY、IbZDS和IbCHYB的表达水平分别比SS8高2.9倍、1.8倍和2.1倍。此外，在本研究中的6个块根发育阶段，XS18中IbCCD4的表达均高于SS8（图4-B）。
图4. 植物类胡萝卜素代谢途径及RT-qPCR检测甘薯中13个基因的表达谱
3. 甘薯块根类胡萝卜素代谢基因表达与类胡萝卜素水平的相关性分析
本研究采用Pearson相关分析方法评价类胡萝卜素代谢基因表达与类胡萝卜素含量的关系，结果如下图，在XS18中未发现明显相关性，在XX中，β-隐黄质的含量与IbLCYB的表达呈较高的正相关关系，玉米黄质含量与IbPSY、IbZDS、IbLCYB和IbCHYB的表达呈正相关，总类胡萝卜素含量与IbZDS、IbLCYB和IbCHYB的表达呈正相关。在SS8中，IbPSY的表达量与β-胡萝卜素、β-隐黄质、γ-胡萝卜素、（E/Z）-植物烯和总类胡萝卜素的含量呈正相关。β-隐黄质和总类胡萝卜素的含量与IbGGPS和IbCHYB的表达均呈正相关。IbNCED3的表达与β-胡萝卜素、β-隐黄质和总类胡萝卜素的含量呈很强的正相关关系。
图5. 甘薯品种中13个类胡萝卜素相关基因与特殊类胡萝卜素相关性的热图
4. IbCCD4基因克隆与功能验证
本研究采用Pearson相关分析方法评价类胡萝卜素代谢基因表达与类胡萝卜素含量的关系，通过转愈伤组织，构建过表达IbCCD4的甘薯，检测类胡萝卜素含量变化及其对几种内源性胡萝卜素基因表达量影响。发现IbCCD4的过表达导致了与类胡萝卜素通路相关的关键内源性基因的表达水平发生了显著的变化，IbCCD4在测定甘薯块茎根中类胡萝卜素的积累中起着关键作用，过表达IbCCD4的块茎根抑制总类胡萝卜素含量积累（图6）。
图6. 在甘薯中过表达IbCCD4减少了块根中类胡萝卜素的积累
5. 转录因子IbWRKY20和IbCBF2与IbCCD4启动子相互作用
CCD4是不同植物不同器官中类胡萝卜素转换的关键调控因子，此外，CCD4的分解代谢产物是参与非生物胁迫反应的重要生物活性物。为了研究直接调控IbCCD4的潜在转录因子，接着克隆了IbCCD4启动子序列，并通过元件功能分析，在启动子上选择了含有ABRE元件、W-box、T/G box、CGTCA和TGACGmotif的约260 bp的片段作为诱饵，进行酵母单杂交筛选实验，结果共筛选到40个互作蛋白，对其中的IbWRKY20和 IbCBF2进行了一对一互作验证（下图）。发现这两个转录因子可以激活IbCCD4启动子，根据基因功能注释，推测IbCCD4可能通过调节类胡萝卜素代谢参与植物非生物胁迫调控。
图7. Y1H检测显示了IbCCD4启动子与IbWRKY20和IbCBF2的物理相互作用
本项目中甘薯块根酵母cDNA文库由欧易生物构建。
山西农业大学博士研究生张洁为该论文的第一作者，贾小云教授为通讯作者。团队成员董静静博士、赵彩良博士、贺立恒教授、唐锐敏副教授、王文斌教授、李润植教授，山西农业大学棉花所甘薯课题组武宗信、谢红娥，河南大学棉花生物学国家重点实验室/生命科学学院王玉杰硕士、浙江农科院作物与核技术研究所季志仙研究员、徐州农科院曹清河研究员和肯塔基大学的袁凌教授也参与了本研究工作。本研究受到国家重点研发计划（2018YFD1000700, 2018YFD1000705）、山西省农业科学院应用基础研究计划（YGC2019FZ4）、山西省研究生科研创新计划（2020BY057）、高端外国专家引进计划（G2022004007L）等项目的资助。
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