多糖药物分析

多糖药物分析

多糖 (polysaccharide) 是构成生命的四大基本物质之一，广泛存在于高等植物、动物、微生物、地衣和海藻等中，如植物的种子、茎和叶组织、动物粘液、昆虫及甲壳动物的壳真菌、细菌的胞内胞外等。多糖在抗肿瘤、抗炎、抗病毒、降血糖、抗衰老、抗凝血、免疫促进等方面发挥着生物活性作用。具有免疫活性的多糖其衍生物常

常还具有其它的活性, 如硫酸化多糖具有抗HIV活性及抗凝血活性, 羧甲基化多糖具有抗肿瘤活性。因此对多糖的研究与开发已越来越引起人们的广泛关注。

组成分类：均一多糖、不均一多糖、粘多糖：含氮的不均一多糖；结合糖：肽聚糖、脂多糖、糖蛋白和蛋白聚糖

1.糖含量测定：确定样品中的糖含量经常使用的方法是显像剂-硫酸法。单糖、多糖及其衍生物在硫酸的作用下水解成单糖，并迅速脱水形成醛衍生物，然后与酚、芳香胺缩合成有色化合物。多糖的含量通过比色定量间接确定。这些方法简单、快捷、灵敏，且对有色化合物具有良好的色泽稳定性。

2.分子量测定：目前比较常用的方法是凝胶过滤法和高效液相色谱法。这两种方法必须使用分子量已知的标准多糖作为对照。HPLC测定分子量及分布：色谱条件：凝胶柱，示差折光检测器。对于分子量小于50,000的多糖，可以使用质谱法。

3.成分分析：多糖成分分析方法一般可分为：传统化学分析、物理分析（仪器分析）和生物学分析。其中，化学分析包括部分或全部酸水解、中和和过滤。最后，使用纸色谱（PC）、薄层色谱（TLC），气相色谱（GC）、液相色谱（HPLC）或离子色谱法进行分析。广泛使用的仪器分析法包括分光光度法、红外光谱法、核磁共振法、气相色谱法和质谱法。

4.结构鉴定：多糖比蛋白质具有更复杂的大分子结构。单糖的多样性、连接方法以及支链的复杂性使得其结构鉴定变得困难。目前，主要结构是多糖结构鉴定的目标，主要分析多糖的分子量范围、单糖的类型、比例和连接顺序以及糖苷键的构型。

单糖的分离鉴定：气相色谱法，hplc，气质联用。

糖苷键连接位置的确定：（1）高碘酸氧化，Smith降解、（2）甲基化反应产物分析、（3）乙酰解后质谱分析。

高碘酸氧化：原理：选择性的氧化降解反应，能够作用于多糖分子中1，2－二羟基和1，2，3－三羟基，生成过碘酸氧化产物；此产物用硼氢化钠还原后，再用酸水解，生成相应的醛、甲酸，室温下用稀无机酸水解还原产物。1，2连接的糖苷键经高碘酸氧化后的产物用硼氢化钠还原得到稳定的多羟基化合物，再用稀盐酸水解，得到甘油及甘油醛。1，3连接的糖苷键与高碘酸不起反应，经还原与水解后得到原来的单糖。1，4连接的糖苷键经高碘酸氧化后的产物用硼氢化钠还原，用稀盐酸水解得到最终产物为赤藓醇和乙醇醛。1，6连接的糖苷键：得到甘油及乙醇醛。

甲基化反应产物分析：多糖经甲基化作用使分子中的羟基甲基化，然后用甲酸和三氟醋酸水解，以气相色谱鉴定甲基化水解产物。

乙酰化后质谱分析：多糖经过乙酰化反应（醋酐、冰醋酸）生成乙酰化单糖和寡糖。用氯仿抽提，蒸去氯仿，进行质谱分析。分子离子峰如有二乙酰葡萄糖或二乙酰单糖碎片峰，表明有支链结构。