腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)是一种高效安全的转基因载体,因其能长期表达、毒性低、组织特异性高等优势,已成为基因治疗领域最重要的基因载体之一。
而AAV的难点在于精确控制药品的效价、效力、纯度以及空壳率。采用体积排阻色谱法与多角度光散射(MALS)相结合,可以表征AAV样品成分,包括分子量、衣壳和DNA的摩尔质量、聚集体和滴度。沃特世XBridge Premier GTx BEH SEC 450 Å 2.5 μm色谱柱能为摩尔质量、分子量、聚集体检测以及空壳率监测提供高灵敏度和高效率的方法。
产品优点
更好的分离效果
实现MALS低噪声,测量完整AAV
快速区分聚集体和单体,实现相对定量
适用多种AAV血清型,样品用量少,提升灵敏度和回收率
分析方法
SEC-MALS分析AAV病毒载体的质量表征
SEC可与MALS联用,进行更多属性的分析。通常SEC结合UV、FLR、RI检测器,根据溶液中分子量的大小来分离,但无法将空AAV和实心AAV分离出来,所以需要通过SEC -MALS来分析样品的分子量、聚集体、颗粒及衣壳含量。Wyatt ASTRA软件利用UV、RI、MALS、DLS的数据组合来确定分析物的物理属性,包括其粒径、分子量和衣壳含量。
图1. Premier GTx BEH SEC 450 Å 2.5 μm 4.6 x 150 mm色谱柱分析BSA(2 mg/mL)、BTG(4.5 mg/mL)和 AAV2-空衣壳(2E+13 vg/mL)的SEC色谱图。
表1. 用SEC-MALS测定AAV2、BTG和BSA的生物物理特性。
SEC-MALS增强AAV的表征
在低流速(<0.3 mL)条件下,XBridge Premier GTx BEH SEC 450 Å 2.5 μm色谱柱表现出低MALS噪声和高灵敏度MALS信号检测。
图2. Premier GTx SEC 450 Å 2.5 μm 4.6 x 300 mm色谱柱分析SEC-MALS AAV2-EMPTY衣壳的特征色谱图。
通过SEC-MALS分析AAV9血清型(空衣壳)
AAV以多种血清型存在,但并非所有血清型都表现出相似的成分特征。通过SEC-MALS分析AAV9(空衣壳)血清型,Premier GTx SEC 450 Å 2.5 μm 4.6 x 300 mm色谱柱可有效分离AAV9单体中的聚集体。
图3. Premier GTx SEC 450 Å 2.5 μm 4.6 x 300 mm 色谱柱分析AAV9-空衣壳色谱图。
重现性一致
按照Empower软件的建议放大进样体积和流速(4.6 mm为15 μL,7.8 mm为43.1 μL,流速分别为0.2 mL至0.575 mL),增加柱直径。两种色谱柱的SEC-MALS色谱图呈现一致性。
图4. 两种不同尺寸(4.6 x 300 mm 和 7.8 x 300 mm)的Premier GTx SEC 450 Å色谱柱的数据比较。
结论
XBridge Premier GTx BEH SEC 450 Å 2.5 μm色谱柱对不同AAV血清型体现了出色的分辨率和高效MALS分析能力,可有效分离各种AAV样品的聚集体、单体和低分子量杂质。4.6 mm直径的SEC色谱柱可配对大型流通池MALS检测器。SEC-MALS提供了强大的多属性分析功能,如确定空载率以及快速测量绝对摩尔质量和分子量。
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使用XBridge Premier GTx BEH SEC 450 Å 2.5 μm色谱柱通过SEC-MALS增强AAV的表征
使用XBridge Premier GTx BEH SEC 450Å 2.5μm色谱柱改进的腺相关病毒(AAV)体积排阻色谱
XBridge Premier GTx BEH SEC 450 Å 2.5 μm 4.6 x 150 mm
XBridge Premier GTx BEH SEC 450 Å 2.5 μm 4.6 x 300 mm
XBridge Premier GTx BEH SEC 450 Å 2.5 μm 7.8 x 300 mm