肽图分析是根据蛋白质、多肽的分子量大小以及氨基酸组成特点，使用专一性较强的蛋白水解酶作用于特殊的肽链位点，将多肽裂解成小片段，通过分离检测手段形成特征性谱图。
肽图分析用于质量控制、生物过程、分析开发，以提供有关生物治疗蛋白质一级结构的全面信息。其样品制备非常复杂，在分析之前，需要将蛋白质样品在碱性缓冲液中处理并酶解生成肽。沃特世Waters PeptideWorks胰蛋白酶试剂盒可为治疗性蛋白的常规肽图分析提供快速可靠的样品制备。PeptideWorks试剂盒使用RapiZyme胰蛋白酶。Rapizyme可以实现快速、彻底酶解蛋白,同时也支持Andrew+自动化操作，工作流程如图1所示。
图1. PeptideWorks胰蛋白酶试剂盒制备蛋白样品的工作流程。
产品优势
试剂盒实现了快速、高通量的肽图分析样品制备，可应用于各种质控和研究；
可在2.5小时内自动化制备24个肽图样品；
重复制备的样品重现性好，酶解彻底，方法诱导的肽修饰很低；
与其他固定化胰蛋白酶相比，可减少93%的漏切和55%的非特异性酶解。
实验方法
实验步骤
NISTmAb(单克隆抗体标准品)样品按照下述程序手动或自动化制备，
1.
NISTmAb 样品 (10 mg/mL) 在5 M 盐酸胍 (GuHCl) 和 5 mM 二硫苏糖醇 (DTT) 的溶液中变性并还原，在室温下反应30分钟。然后加入碘乙酰胺 (IAM) 至终浓度为 10 mM，并将样品在室温、避光下孵育 30 分钟。
2.
使用Sep-Pak SEC脱盐柱对样品进行脱盐，并用酶解缓冲液（10 mM CaCl2和100 mM tris HCl，pH 7.5）更换缓冲液。测定蛋白质浓度并使用酶解缓冲液将样品浓度归一化至0.1 mg/mL。
3.
用RapiZyme胰蛋白酶以酶:蛋白质1:5的比例，在37 ℃下酶解30分钟。用10 μL的1%甲酸终止并混匀。
注：此方案同时也适用在自动化Andrew+移液机器人上进行。
液相色谱条件
液相色谱系统：
ACQUITY UPLC I-Class PLUS
色谱柱：
ACQUITY Premier Peptide CSH C18色谱柱, 130Å, 1.7 µm, 2.1 x 150 mm(PN：186009489)
柱温：
65 °C
样品温度：
6 °C
进样量：
10 µL
流动相A：
0.1% 甲酸水溶液
流动相B：
0.1% 甲酸乙腈溶液
梯度表
ACQUITY RDa检测器设置
质量范围：
50-2000 m/z
模式：
全扫描，碎片化
电离模式：
ESI+
采样率：
2 Hz
锥孔电压：
20 V
碎裂电压：
60-120 V
脱溶剂气温度：
350 °C
毛细管电压：
1.20 kV
锁定质量数：
waters_connect
数据管理
色谱软件：
waters_connect
结果与讨论
PeptideWorks自动化工作流程
经优化，RapiZyme胰蛋白酶能将蛋白快速酶解完全，工作流程支持手动操作，也支持Andrew+自动化机器人（图2）。
图2. PeptideWorks手动和自动样品制备工作流程的流程图。
自动化PeptideWorks工作流程分为两个方案：方案A进行变性、还原和烷基化，方案B进行浓度归一化和酶解。最多可容纳24个样品，平台布局如图3所示。
图3. 自动化PeptideWorks工作流程布局。
手动与自动样品制备
手动和自动制备样品均具有高覆盖率（预期肽>88%）的色谱结果。修饰肽的相对丰度在手动和自动样品制备工作流程之间是一致的（图4）。
图4. 使用手动和自动PeptideWorks工作流程制备的NISTmAb酶解的BPI色谱图，显示相同的结果。
PeptideWorks的完整性、特异性酶切
手动和自动PeptideWorks工作流程中漏切和非特异性酶解率低于5%，酶解效率高，不会过度酶解蛋白。PeptideWorks可减少93%漏切，非特异性酶解减少55%。与固定化胰蛋白酶消化试剂盒相比，PeptideWorks提供了更加完整和特异性的酶解，提高了重现性，并实现了更快的数据处理（图5）。
图5. 手动和自动PeptideWorks工作流程以及固定化胰蛋白酶酶解试剂盒制备NISTmAb酶解中漏切和非特异性酶解的相对丰度。
肽修饰表征和重现性
使用自动化PeptideWorks工作流程在三天内制备的三批NISTmAb酶切选定肽修饰的相对丰度与手动工作流程制备的NISTmAb酶的结果一致。每种肽的未修饰肽丰度的RSD小于15%，在使用PeptideWorks进行样品制备时，肽回收率、定量限一致。对于每种修饰肽相对丰度的RSD小于10%。
图6. 左：自动化PeptideWorks工作流程制备三批NISTmAb酶解的选定肽修饰的相对丰度。右：未修饰肽和修饰肽相对丰度的RSD。
结论
PeptideWorks胰蛋白酶试剂盒展现了高效和可重现的肽图结果，在Andrew+机器人上实现了全自动的肽图分析工作流程，包括使用新的Sep-Pak SEC脱盐柱，蛋白质回收率可达≥80%；胰蛋白酶酶解更完整，漏切、多切率减少了10倍，同时与 Andrew+机器人上的自动方案相比，还能够为手动工作流程提供等效结果。
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使用PeptideWorks试剂盒，使用简单、自动化的工作流程进行肽图分析的样品制备
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