类固醇激素，又称甾体激素，是一类四环脂肪烃化合物，具有环戊烷多氢菲母核，因其在维持生命、调节性功能、对机体发展、免疫调节、皮肤疾病治疗及生育控制方面的明确作用，临床表征中经常会作为疾病诊断的参考。因此，相关激素在临床样本中准确的定性和定量就变得尤为重要。今天我们分享一种用LC-MS/MS方法检测临床中19种类固醇激素的方案供大家在实践中参考。
表1 分析的19种类固醇激素
图1 分析物代表性结构及其与色谱柱固定相的相互作用
筛选用到的液相条件：
色谱柱：
色谱柱
规格
Kinetex C18
2.6μm，50*2.1mm
Kinetex XB-C18
2.6μm，50*2.1mm
Kinetex EVO C18
2.6μm，50*2.1mm
Kinetex Polar C18
2.6μm，50*2.1mm
Kinetex Biphenyl
2.6μm，50*2.1mm
Kinetex Phenyl-Hexyl
2.6μm，50*2.1mm
流动相：
A：0.5mM氟化铵水溶液
B：甲醇
梯度信息：
Time (min)
%B040
6.5
95795
7.5
40840
流速：0.6mL/min
进样量：5μL
温度：40℃
液相系统：通用HPLC
质谱条件：
离子源类型：电喷雾离子源ESI
极性：正离子模式/负离子模式
离子源温度：700℃
雾化器（GS1）：60psi
辅助加热气（GS2）：60psi
气帘气（CUR）：40psi
碰撞气（CAD）：10psi
离子喷雾电压（IS）：3000V/-3000V
射入电压（EP）：10V/-10V
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图2 检测相关色谱图
根据相关色谱图结果显示，我们发现雌酮和雌二醇的选择性在联苯色谱柱上表现最高。对于包括睾酮、雄烯二酮、DHT、DHEA和DHEAS在内的雄激素，传统C18或EVO C18都可以进行高效的分离；对于肾上腺类固醇类激素来说，包括11-脱氧皮质醇、17-羟基孕酮、17-羟基孕烯醇酮和孕烯醇酮，在上述Kinetex核壳柱都可以达到很好的选择性结果。
苯基己基柱在选定的激素异构体的分离中效果一般，苯己基不能提供睾酮和DHEA异构体的完全基线分离，也不能分离皮质酮和11-脱氧皮质醇，但是分离雌酮和雌二醇效果较好。而对于同分异构体皮质醇和18-羟基皮质酮，传统C18和EVO C18以及Polar C18都显示出最大的选择性和最佳的分离。
对于所有19种类固醇分析物来说，Kinetex C18核壳柱（2.6μm, 50x2.1mm）在相应HPLC条件下得到了最佳的分离，运行时间仅为8分钟。在经过进一步的条件优化之后，我们选定以下条件作为19种类固醇分析物LC-MS/MS方法的最终结果。
最终方案
液相条件：
色谱柱：Kinetex 2.6μm C18 (00B-4462-Y0)
规格：50X3.0mm
流动相：
A：0.5mM氟化铵水溶液
B：甲醇
梯度信息：
Time (min)
%B040250
4.5
75595695
6.5
40840
流速：0.8mL/min
进样量：5μL
温度：30℃
液相系统：通用HPLC
质谱条件：
离子源类型：电喷雾离子源ESI
极性：正离子模式/负离子模式
离子源温度：700℃
雾化器（GS1）：60psi
辅助加热气（GS2）：60psi
气帘气（CUR）：40psi
碰撞气（CAD）：10psi
离子喷雾电压（IS）：3000V/-3000V
射入电压（EP）：10V/-10V
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