在神经生物学，干细胞研究，再生医学和癌症生物学中，类器官和球状体模型的使用频率越来越高。这些3D模型内的细胞相互作用、细胞分裂、形态学，以及基因和蛋白表达等方面更接近体内真实情况，更准确地模拟了细胞的自然环境，进而实验结果的生理相关性更高。2D和3D细胞模型的对比请见下表：
表1. 2D和3D细胞模型的对比
3D培养的细胞、类器官和球状体需要特殊样品处理和染色方法，才能使用荧光显微镜进行观察。相对于2D培养的细胞来说，3D培养细胞有一定厚度，导致光无法有效透过。使用成像法观察固定3D细胞模型（包括类器官和球状体）时，建议使用透明化试剂处理样品，以获得清晰明亮的荧光图像。
图1. 透明化处理可显著改进球状体荧光染色结果（A549球状体）。
细胞核：Hoechst，蓝色，货号H21486；增殖：AF488-EdU，绿色，货号C10337；AF647-Ki67，紫红色。
试剂和耗材
图 2. HeLa 球状体缺氧内核检测。
缺氧：Image-iT 缺氧检测试剂（红色，货号H10498）；复染：NucBlue Live ReadyProbes 试剂（蓝色，货号R37605）。
实验步骤
小贴士
我们建议您减掉移液管尖端、扩大开口，以保护球状体结构。
本方案建议用于厚度在500微米以内的球状体。
阅读荧光染料和试剂的说明书：并非所有的染料和试剂都可以固定，许多染料和试剂需要在固定前使用。
我们强烈建议您在使用透明化试剂盒之前优化好一抗浓度：用梯度稀释的抗体染色阳性和阴性对照样品，稀释倍数包括1:10、1:100、1:500、1:1000；较厚的球状体可能需要更多的抗体。
球状体固定和透明化
（上下滑动，查看3D成像详细实验步骤）
球状体可以在组织培养板内直接固定，或转移到离心管中进行固定。
500 g离心样品5 分钟。轻轻去除培养基。
用冷 PBS 清洗样品一次。500g离心5分钟，除去上清液。
（可选）固定前加入细胞活力检测试剂（具体方案请见下文）。我们建议使用 LIVE/DEAD 可固定染料进行活力染色。
加入 4% 多聚甲醛，体积约为组织体积的 10 倍。确保组织浸没在固定剂中。室温固定 1 小时，保持轻柔震荡。
用冷 PBS 清洗样品一次。500 g 离心 5 分钟，除去上清液。
室温透明化球状体 15 分钟，保持轻柔震荡。推荐的透明化试剂包括CytoVista 抗体渗透缓冲液。
500g 离心 5 分钟，除去上清液。
用含 1% 胎牛血清的 PBS 清洗样品两次。
500g 离心 5 分钟。除去上清液。
用封闭缓冲液（例如 CytoVista 封闭缓冲液）在 37 ℃ 下封闭样品 2 小时，保持轻柔震荡。
标记
小贴士
滴定一抗浓度以获得最佳结果：一抗过多或过少都会导致标记效果欠佳或无标记；抗体浓度可能需要根据组织的厚度而变化。
抗体孵育条件可能需要根据具体样品和实验进行优化。
加入在 CytoVista 抗体稀释缓冲液中制备的一抗。
室温孵育样品过夜，保持轻柔震荡。
用 CytoVista 清洗缓冲液清洗样品 3 次，以去除未结合的抗体。500 g 离心 5 分钟，除去上清液。
加入在 CytoVista 抗体稀释缓冲液中制备的二抗。
注意：建议进行抗体滴定以找到最佳浓度。
室温孵育样品过夜，保持轻柔震荡。
每 mL 样品添加 1 滴NucBlue 复染剂；或加入DAPI复染剂，工作浓度 300 nM。
室温孵育样品 30 分钟，保持轻柔震荡。
500g 离心 5 分钟，除去上清液。
用 CytoVista 清洗缓冲液清洗样品 3 次。500 g 离心 5 分钟，除去上清液。
封片
可以将 SlowFade 封片剂加到成像玻璃皿中的样品上。也可以把球状体转移到盖玻片，在球状体上滴加1~3滴 SlowFade 封片剂，最后将盖玻片放在载玻片进行成像。
小贴士
在使用前，请确保 SlowFade 抗淬灭封片剂升温至室温。如果试剂是冷冻储存的，请在室温下解冻 1 小时。请勿摇动试剂瓶，以防产生气泡。
成像
我们建议使用有 Z stack 功能的显微镜，例如 Invitrogen EVOS M5000、EVOS M7000 或 CellInsight CX7 高内涵平台。Celleste 6 图像分析软件具有 2D/3D 去卷积功能，可助您获得更清晰的图像。
图3. CellInsight™ CX7 LZR Pro 高内涵筛选平台
类器官功能检测常用试剂
细胞活力检测
推荐使用 LIVE/DEAD 活力/细胞毒性试剂盒（货号 L3224）。固定前进行下列步骤。
将 5 µL 组分 A 和 20 µL 组分 B加到 10 mL DPBS 中，以制备染色溶液。
将 100–200 µL 染色溶液直接添加到细胞中。
室温避光孵育 2 小时，保持轻柔震荡。
活球状体细胞活性氧 (ROS) 检测
推荐使用 CellROX Green 试剂（货号 C10444） 在固定前进行活性氧检测。只有 CellROX Green 和 Deep Red 可以固定和透化。
小贴士：使用100 μM 甲萘醌处理后的球状体作为阳性对照。
将 CellROX Green 染料添加到培养基中，终浓度为 5 µM（例如，每 500 µl 培养基添加 1 µl）。
室温避光孵育 2 小时，保持轻柔震荡。
用 PBS 清洗。500 g 离心 5 分钟。轻轻除去上清液。重复 3 次。
固定。后续可进行抗体染色和 NucBlue Live ReadyProbes 试剂（货号 R37605）复染。
图4. 检测药物处理的 HeLa 球状体中的细胞活力和氧化应激。
A–C：在使用Live/Dead细胞成像试剂盒（货号R37601）检测的球状体中，活细胞发出绿色荧光，死细胞发出红色荧光。D–F：在用 CellROX Deep Red 试剂（货号C10422）和 NucBlue Live ReadyProbes 试剂（货号R37605）染色的球状体中，氧化应激的细胞发出红色荧光，而活细胞细胞核发出蓝色荧光。
细胞凋亡检测
注意：固定前进行下列操作。仅 CellEvent Caspase 3/7 Green 和 Red可固定。
在样品中加入CellEvent Caspase 3/7 检测试剂，终浓度2 μM；每 mL 样品中加 1 滴 NucBlue进行细胞核复染。
室温避光孵育 2 小时，保持轻柔震荡。
用 PBS 清洗。500 g 离心 5 分钟。轻轻除去上清液。
固定等后续操作。
图5. 乳腺癌球状体中的 NK 细胞 ADCC 检测（抗体介导细胞毒性实验）。
细胞示踪：CellTracker Deep Red，紫红色，货号 C34565；凋亡：CellEvent Caspase 3/7 Green，绿色，货号C10423；细胞核：NucBlue Live，蓝色，货号R37605。
细胞增殖检测
（上下滑动，查看3D成像详细实验步骤）
注意：在细胞培养时进行下列操作。
优化细胞培养条件，确保球状体在生长阶段。在细胞周期S 期加入Click-iT Plus EdU 细胞增殖试剂。
将 2 mL 组分 C （DMSO）或等体积水性溶剂加到组分 A 中，制成 10 mM EdU 母液。–20 ℃ 保存。
将组分 D 瓶中的溶液 (4 mL) 转移至 36 mL 去离子水中，制备 1X Click-iT EdU 反应缓冲液。2–8 ℃ 保存。
将 2 mL 去离子水添加到组分 F 中并混合直至完全溶解，制成 10X Click-iT EdU 缓冲添加剂。–20 ℃ 保存。
用含 20 μM EdU 的新鲜培养基 37 ℃ 培养细胞过夜。增殖细胞将在此阶段把 EdU 加到DNA中。
固定细胞后进行 EdU 检测和DNA染色。详细步骤请见Click-iT Plus EdU 细胞增殖试剂盒说明书。
参考文献：
1. Badr-Eldin, Shaimaa M., et al. “Three-Dimensional in Vitro Cell Culture Models for Efficient Drug Discovery: Progress so Far and Future Prospects.” Pharmaceuticals, vol. 15, no. 8, 27 July 2022, p. 926, https://doi.org/10.3390/ph15080926. Accessed 14 Oct. 2022.
2. Sherman H, Gitschier HJ, Rossi AE. A Novel Three-Dimensional Immune Oncology Model for High-Throughput Testing of Tumoricidal Activity. Front Immunol. 2018;9:857. Published 2018 Apr 23. PMID: 29740450
3. Mittler F, Obeïd P, Rulina AV, Haguet V, Gidrol X, Balakirev MY. High-Content Monitoring of Drug Effects in a 3D Spheroid Model. Front Oncol. 2017;7:293. Published 2017 Dec 11. PMID: 29322028
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