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血浆中游离MNs的检测
前言
游离型甲氧基肾上腺素类物质(MNs)包括甲氧基去甲肾上腺素(Normetanephrine, NMN)和甲氧基肾上腺素(Metanephrine, MN)。它们主要来源肿瘤细胞，与儿茶酚胺长期分泌增加有关，不受肾上腺交感神经兴奋影响，半衰期相对较长，不易产生波动，能够准确的反应嗜铬细胞瘤儿茶酚胺合成的真实情况。临床上检测游离MNs已经是诊断嗜铬细胞瘤的重要指标了。
本文建立了由LabTech SepLineSPE全自动固相萃取仪净化血浆中游离MNs，并用HPLC进行含量测定的方法。SepLine全自动固相萃取系统的密闭性及溶剂回收功能，可保护操作人员免受有毒有害物质的危害。同时降低了实验室工作量，提高了工作效率，保证结果的平行性和准确性，具有较高的回收率。
实验过程
1.1 实验室设备
固相萃取仪：SepLine全自动固相萃取系统，莱伯泰科美国公司 ；
高效液相色谱仪：LC600 二元高压梯度高效液相色谱， 北京莱伯泰科仪器股份有限公司；
浓缩仪：Vortex 600全自动浓缩仪， 北京莱伯泰科仪器股份有限公司；
固相萃取柱：LabTech SCX 500mg/3mL
1.2 试剂
1%KOH:甲醇、10mM醋酸:甲醇、10mM磷酸铵，pH8.5、10%NH4OH:甲醇（1:3）、0.2M 醋酸、流动相储存液
血浆：客户提供
1.3 标样配制
1.3.1 标样储备液
分别称取5mg的DL-NormetanephrineHCL(NMN)、DL-MetanephrineHCL(MN)和3-Methoxy-4-hydroxybenzylamineHCL(HMBA)，用5mL 0.2M 醋酸分别溶解，得到浓度都为1mg/mL的三种标样储备液。
1.3.2 标样工作液
分别吸取1mg/mL的NMN，MN，HMBA标样储备液20μL至一20mL棕色容量瓶，用0.2M醋酸定容，得到浓度都为1μg/mL 的NMN\MN\HMBA混标。
1.4 加标样品
取30μL 标样工作液、600μL 0.2M醋酸至同一试管中，最后用血浆定容至9mL。
1.5 固相萃取
图1为Sepline固相萃取过程。其中进样量为6mL。
1.6 浓缩定容
将3mL洗脱液倒入Vortex 600浓缩杯中，在真空（-0.07MPa）和氮气吹扫的同时作用下，将萃取液浓缩至干（约1h），最后用500μL 0.2M醋酸复溶，待HPLC分析。
1.7 HPLC分析
色谱柱：Promosil C18，5μm，4.6*150mm
流动相：100mL流动相储存液+65mL乙腈+去离子水至950mL，用磷酸调pH到3.2，去离子水定容至1L，0.22um型GV真空过滤。
波长：225nm； 流速：1mL/min；柱温：25℃ ；进样量：50μL
实验结果
2.1 HPLC-UV分析情况2.1.1波长及检测限说明
用紫外分光光度计对NMN、MN和HMBA进行190nm~1100nm的光谱扫描，发现这三种物质吸收光谱相似，且都在225nm处有最大吸收，所以HPLC-UV方法中选定225nm为测试波长。
该实验条件下，HPLC-UV对NMN、MN和HMBA的检测限为10ng/mL。
2.1.2 标样色谱图
图2为40ng/mL 的NMN、MN和HMBA混标色谱图。出峰时间如下表所示。
2.1.3 加标样品色谱图
图3为加标样品的色谱图。图中6.367min和11.270min处的峰分别是NMN和HMBA的色谱峰。而原本在8.782min处的MN峰被杂质峰完全掩盖，试过不同比例的乙腈还是分不开，可能还是需要电化学检测器的高选择性来将MN峰和杂质峰分开。所以之后结果中就只有NMN和HMBA的回收率，MN的回收率无法给出。
2.1.4 浓缩情况说明
图4为浓缩前后标样的色谱对比图。其中蓝色线的是没有进行浓缩的标样，黑色线的是取一定量标样加入3mL 10%氨水:甲醇（1:3），用Vortex进行浓缩干燥，最后定容到一定体积的标样色谱图。
对比浓缩前后，标样色谱峰面积的变化情况，如表2所示。由Vortex浓缩标样的回收率在90.93%~97.36%。
2.1.5加标样品整体回收率及平行性
全自动固相萃取系统Sepline是4通道，实验中1,2,3通道走加标样品，4通道走空白。洗脱液经浓缩，复溶和HPLC分析。最后和相应浓度（40ng/mL ）的标样进行对比，得出各通道的整体回收率及通道间的平行性，数据见表3。
