共聚焦平台系列二：灵敏度

牛津仪器科技

2018.2.02

作者牛津仪器

TA的动态

灵敏度对于所有显微镜成像研究至关重要，它可以衡量光的利用效率，决定仪器能探测到的最弱标本信号能力。

弱样品成像：对于比较弱的荧光样品，点扫描共聚焦不能成像，Dragonfly可以得到更好的信噪比图像。

活细胞成像：高灵敏度，可以降低激光的激发强度，减少细胞的光漂白及光毒性损伤，有利于保持细胞活性。

高速成像：高灵敏可以降低曝光时间（样品信号收集时间），只有这样才能提高采集速度。点扫描共聚焦单纯增加振镜的扫描速度，在每个点上收集信号的时间变短，图像信噪比就会很差。

高分辨率，超高分辨率成像：灵敏度对于超高分辨至关重要，如果灵敏度不够，超高分辨图像反而信噪比更差。

影响灵敏度的关键因素有量子效率（QE）、检测器的读出噪声（RN）以及仪器和测量背景（这里特指平均值和方差）。二维探测器，因其性能所限，固定模式噪声（FPN）成为重要参数。芯片材料灵敏度的细微差异，会产生低水平的结构背景，有时称为光响应不均匀性（PRNU）。相机探测器制造商尽全力校准PRNU，尽量减少其影响。

SNR的理论极限是由光子发射统计性质导致的散粒噪声决定的。SNR的绝对最大值为N1 / 2或检测光子数的平方根，所以收集越多光子，信噪比SNR越好。量子效率QE测量探测器入射光子数转化光电子（信号）的效率。对于一定数量的入射光子，SNR信噪比可以用下面公式表示：图一

点扫共聚焦利用光电倍增管（PMT）进行检测，QE受限于装置中使用的光电阴极材料。根据波长和光电阴极材料，高端仪器PMT的典型QE值为10-40％（Hamamatsu2007）。砷化镓磷化镓（GaAsP）光电阴极提供最高的QE，波长范围400-650nm之间，QE超过25％，在该范围以外快速下降，在540nm处达到峰值40％（见下图二）。 PMT通过倍增极链进行电子倍增，并引入倍增噪声（MN）。设计良好的情况下，MN噪声增加约1.25倍，这相当于用MN2的系数减少QE约1.56倍。因此，GaAsP探测器的有效峰值QE约为26％。而且，系统SNR与检测电路带宽的平方根成反比，这对于带宽增加10倍或更多倍的需要快速采集图像的共振扫描又是一个挑战。图二

最近的发展是使用混合检测器（HyD）（Hamamatsu 2007），它将GaAsP光电阴极和直接加速导致的电子结合成硅雪崩二极管（AD）。所得增益远低于PMT，并且高度依赖于温度。但是MN倍增极链的问题减少了，并且HyD在脉冲高度重复性和稳定性方面具有优势。虽然这些探测器经常被引用于光子计数模式（PCM），需要指出的是以12位分辨率显示、每秒30帧、像素为512X512的PCM需要每秒4x1010脉冲的带宽。这些带宽是在专门的TCSPC（时间相关单光子计数系统）（Becker2005）中实现，但这在商业点扫描仪中并不常见。PCM带宽不足导致脉冲堆积和非线性，特别是在高信号条件下会影响线性度。

相比之下，Dragonfly利用新一代背面照明（BSI）电子倍增电荷耦合器件（EMCCD）和科学型互补金属氧化物半导体（sCMOS）芯片，QE峰值在82％和95％之间，宽光谱范围300-950nm。 EMCCD的有效读取噪声由输出放大器读取噪声除以EM增益而得出。Andor的iXon Ultra 888可以提供小于0.2电子均方根（Basden2015）的读取噪声。和PMT一样，EMCCD在增益寄存器中有倍增噪声（MN），但由于其极低的有效读取噪声，实现了单光子灵敏度。EMCCD MN通常为1.41， QE有效峰值约为48%，但仍然是最好的PMT的两倍，且光谱范围更广。（见上图二）

2009年，Andor首次推出了sCMOS探测器(Coates et al 2009)。 sCMOS的主要优点是图像阵列传感器应用复杂电路芯片。这允许同时读取和数字化芯片上的所有行和/或列。例如，一个2048x2048芯片（4 M像素）可以每秒读取100帧，而每个像素仅处理200kHz，因此具有非常低的读取噪声，例如1-2个电子均方根。读取噪声对灵敏度至关重要，特别是在高QE下，如此低的读取噪声使Dragonfly灵敏度远超过点扫描共聚焦。

然而，EMCCD仍然是低信号水平中最敏感的探测器（每像素20-30光子）。在接近相同成像条件下，我们比较了在Dragonfly中运行的EMCCD和sCMOS，同时增加了曝光时间和光子计数，以说明相对成像性能（见下图三）。通过有效QE将EMCCD和sCMOS探测器与PMT进行比较，会发现Dragonfy的灵敏度高3-5倍。图三

图三说明： iXon Ultra EMCCD和Zyla 4.2 plus sCMOS相机的灵敏度比较：相机安装在Dragonfly的成像端口上，并使用成像缩放进行像素大小匹配：Zyla在1X变倍和iXon在2X变倍，像素大小均为6.5μm。相同的样本在这两台相机上以交错曝光的方式继续成像（Zyla:iXon:Zyla:iXon等）。因此，一个相机就不会因漂白而处于劣势。sCMOS与EMCCD提供相似图片信噪比的“交叉”点是每个像素20到30个光子。