亲和质谱分析的基本原理是:首先获得配体与靶蛋白结合的复合物,而后采用某种纯化方法将复合物与溶液中未结合的配体分离,最后对从复合物中解离下来的配体进行液质联用分析从而鉴定其配体结构。研究者通常从大量化合物库中筛选出与靶蛋白发生特异结合作用的小分子配体,如此的混合物筛选方式可以显著提高筛选通量和降低成本。
水雯箐研究员2016年初加入上海科技大学,在iHuman研究所建立了配体筛选与组学技术课题组,是国内较早开展亲和质谱用于药物靶标配体高通量筛选的学者之一。其团队的研究以生物质谱技术为核心,结合生物化学、分析化学、药物化学和计算生物学等手段,围绕关键药物靶标蛋白尤其是G-蛋白偶联受体家族开展配体发现和作用机制的研究。
图2. 亲和质谱筛选GPCR配体实验流程:(a)靶标为5-羟色胺受体2C(5-HT2CR),是一种治疗抑郁症、精神分裂症等精神类疾病的药靶。表达5-HT2CR的昆虫细胞膜直接与复杂小分子混合物进行孵育,通过抽滤法将细胞膜与溶液相分离,与受体表达的膜组分相结合的化合物解离后使用高分辨液质联用TripleTOF检测分析。(b)由LC-MS分析获得的Binding Index能一定程度上反映每种化合物与靶标受体的相对结合强度。(c)对小分子混合物进行筛选的LC-MS色谱图,分别来自靶标组和对照组的配体混合物。(d)用OPLS-DA模型对LC-MS数据进行多元统计分析。
“亲和质谱配体筛选技术的关键有如下几点,样品方面需要有大量化合物库的累积,针对特定的靶标蛋白需要优化亲和选择的方法和流程,质谱分析方面则需要较高的仪器灵敏度和分辨率从而保证从成千上万的小分子混合物中鉴定有亲和力的化合物,而软件对大量小分子的平行处理能力有利于快速提取可能的配体峰信号。SCIEX 高分辨质谱TripleTOF®6600和PeakView®软件为亲和质谱筛选提供了很好的助力。
实验中我们只筛选了4333 个化合物,鉴定到了12 个已知的5-HT2CR 小分子调控剂,并发现了若干未知的新结构配体。通过进一步的放射性同位素配体实验和细胞钙流实验,我们发现了一个作用于5-HT2CR 的新结构拮抗剂。另一个我们研究的GPCR 靶标人胰高血糖素样肽-1 受体(GLP-1R)则更具挑战性。对于该受体,目前已报道的非肽类小分子调节剂十分罕见。利用我们的高通量亲和质谱筛选技术,结合放射性同位素配体实验以及细胞活性实验,我们发现了4 个特异靶向GLP-1R 的新型别构激动剂。”
1. Qin, S, et al, Chemical science 2018, 9, 3192-3199
2. 汪志华等,生命的化学, 2017, 37(1): 113-120
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