景杰编者按：胆固醇、脂肪酸是生命活动中所必需的脂类分子，但是这些极性分子如果在体内过量积累会导致病变，比如动脉硬化、II型糖尿病。已知脂类分子过度累积常会导致活性氧ROS的累积，导致氧化损伤。然而人们对细胞如何感受这些脂质分子产生的氧胁迫并应对知之甚少。最近著名学术期刊Nature Cell Biology的一篇文章解决了上述问题。武汉大学宋保亮教授与中科院生化细胞所李伯良研究员合作，揭示胆固醇酰化转移酶ACAT2的277位半胱氨酸（C277）可以被脂质积累产生的ROS氧化，抑制该位点的泛素化而延缓蛋白降解。因此稳定的ACAT2蛋白可以酰化修饰过量的极性脂类分子，降低其细胞毒性。该研究揭示了特殊的泛素化修饰：半胱氨酸泛素化修饰，并揭示其重要生物学意义。景杰生物作为全球蛋白质及翻译后修饰的领跑者，可以为您提供一整套常规蛋白质组学及修饰组学研究的解决方案，同时还能为您提供高灵敏度的修饰类泛抗体，助力您的研究工作。
关键词：半胱氨酸、泛素化、半胱氨酸泛素化、ACAT2、胆固醇、活性氧、ROS、糖尿病
研究思路和成果：
胆固醇酰化转移酶ACAT位于内质网膜，催化胆固醇与脂肪酸间酯键的形成，生成胆固醇酯。该酶是胆固醇及其酯类代谢平衡的关键酶之一，在胆固醇的吸收、转运、细胞膜功能作用等生理过程发挥极其重要作用。病理上，它在巨噬细胞中大量地合成胆固醇酯，形成泡沫细胞（动脉硬化等早期病变）；影响神经细胞膜内的胆固醇，直接调节产生A-beta，从而与Alzheimer disease相关；在肝肠细胞中的活性变化，影响胆固醇酯的合成与血液转运，而与高胆固醇相关。人的ACAT家族基因有两个成员ACAT1、ACAT2，前者在各种组织细胞中广泛表达，而ACAT2基因主要在肝肠细胞表达。
研究人员首先发现甾醇（胆固醇sterol）和饱和脂肪酸（如PA, 16:0）能够稳定ACAT2，植物甾体（sitosterol等）却没有此效果 （图 1）。
图1. 左图，甾醇处理能稳定ACAT2，植物甾醇则无此效果。右图，饱和脂肪酸也能稳定ACAT2蛋白。随后实验表明胆固醇、饱和脂肪酸稳定ACAT2蛋白和抑制其泛素化修饰有关 （图 2），接下来就是鉴定具体的泛素化位点。一般泛素化发生在蛋白质赖氨酸侧链，但是研究者将ACAT2上所有赖氨酸突变后，发现其泛素化水平仍然被脂质诱导，表明存在其它的泛素化位点 （图 2）。
图2. 左图，脂质处理会抑制ACAT2蛋白泛素化。右图，ACAT2泛素化不在其赖氨酸残基上
作者通过domain truncation寻找泛素化区域，最后发现泛素化发生在第252-279区域，而泛素化还可能发生在Ser、Thr、Cys残基上，因此通过点突变实验发现泛素化发生在Cys277上 （图 3）。
图 3. ACAT2泛素化发生在C277残基上
一般来讲，蛋白质赖氨酸发生的泛素化修饰比较稳定，而半胱氨酸上泛素化修饰不稳定，在一定还原剂作用下会去修饰。那么ACAT2的泛素化发生在半胱氨酸上是否暗示其受氧化还原调控？研究人员利用DCP-biotin探针去检测ACAT2的C277，是否能在在脂质处理诱导的ROS条件下产生sulfenic acid。最后结果证实了C277的确在ROS条件下会被氧化 （图 4）。
图 4. 利用DCP-biotin探针检测C277巯基的氧化态
接下来研究人员鉴定催化ACAT2的Cys277泛素化的E3 ligase。利用ACAT2抗体亲合层析，结合蛋白质质谱技术，研究人员鉴定了一个ACAT2结合蛋白E3 ligase，gp78，通过遗传实验证明其具有泛素化活性 （图 5）。随后的转基因小鼠模型中，ACAT-／-小鼠不能将累计的活性脂质转化为较为惰性的酯类，加速了高脂食物诱导的insulin resistance，稳定了ACAT2蛋白则可以减轻insulin resistance。
图5. GP78 KO细胞中，即使在没有脂质处理的条件下ACAT2含量也显著高于对照
总结：本研究具有多项成果，揭示了脂类如何通过影响Cys氧化，抑制其泛素化而稳定ACAT2，从而调节体内脂类活性状态的水平；揭示了Cys泛素化及其生物学意义；鉴定了Cys泛素化酶 E3 ligase。总而言之，ACAT2作为细胞内膜上，感受胞内感应ROS sensor，调控胞内脂类活性状态。对研究、治疗ROS诱发的一些代谢疾病，比如II型糖尿病都有很重要的参考价值。
参考文献：
Yong-Jian Wang , et al. Cholesterol and fatty acids regulate cysteine ubiquitylation of ACAT2 through competitive oxidation, Nature Cell Biology 19,808–819 (2017)
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