最能体现一个人对膜蛋白的了解，原来是这个“修饰”！点开下方有惊喜哦！

棕榈酰化修饰是蛋白质翻译后脂质修饰的重要形式之一，在细胞信号传导、代谢、凋亡、疾病的发生、发展等过程中都起着重要的作用。棕榈酸盐是丰度最高的脂肪酸，可被共价修饰到蛋白质上。根据连接方式不同，棕榈酰化修饰可分为N型（通过酰胺建连接到Gly/Cys残基上）和S型。蛋白质的S型棕榈酰化修饰（Palmitoylation）是指饱和的16个碳的棕榈酸盐通过硫酯键共价修饰到蛋白质Cys的巯基上，它是一种动态、可逆地翻译后修饰形式，可在时间和空间上调节蛋白质的功能。

许多棕榈酰化修饰的可溶或整合膜蛋白质，如信号蛋白质（包括在癌症和突触信号中断关键因子）、细胞黏附分子和神经递质受体等，可调控蛋白质的活性和稳定性，蛋白-蛋白相互作用，促进蛋白质定位膜脂筏等。

1. 以“棕榈酸盐为中心”的分析方法

1.1 放射性棕榈酸盐代谢标记法

最经典的方法是用放射性棕榈酸盐(例如，³H-palmitate和¹²⁵I-palmitate)代谢标记培养细胞，通过放射自显影检测同位素标记的程度，检测棕榈酰化修饰的蛋白质，其中，³H—palmitate是使用最广泛的放射性标记棕榈酸盐。

但该法操作繁琐、需很长的曝光时间；使用较高浓度的放射性同位素，有害且处理费用高；只能用于检测活细胞中的棕榈酰化修饰蛋白质；产生的信号弱，灵敏度不高，不能检测丰度较低的棕榈酰化修饰蛋白质；无法提供棕榈酰化修饰的化学计量信息，且缺乏直接富集和鉴定放射性标记蛋白质的方法。

1.2 棕榈酸脂类似物代谢标记法

叠氮或炔基脂肪酸探针非常灵敏，为快速检测和富集细胞脂质修饰蛋白质提供了机会。由于含叠氮或炔基的棕榈酸类似物从结构和功能上来说都与它们的天然产物相似，因此能通过代谢通路进入到细胞蛋白质中。将含叠氮或炔基的棕榈酸类似物代谢进人细胞蛋白质，然后通过化学选择性链接如施陶丁格连接或点击化学方法，选择性地将带叠氮或炔基基团的蛋白质连接到生物素或荧光基团上，从而富集或检测棕榈酰化修饰的蛋白质。

与放射性棕榈酸盐代谢标记方法相比，该法不使用放射性同位素，检测时间较短，荧光基团的使用大大提高了方法的灵敏度，可通过亲和纯化富集或利用荧光探针观察棕榈酰化修饰蛋白质。

1.3 以叠氮基团为化学报告基团的方法

有机叠氮是具有高反应活性的功能基团，易被修饰但在细胞环境中具有代谢惰性。研究人员合成了包括12，14，15和16个碳的一系列ω-叠氮脂肪酸类似物作为非放射性探针，这些探针能被有效地代谢进入哺乳动物细胞中，然后利用施陶丁格连接将目标蛋白质结合到生物素化的膦捕获试剂上，最后用链霉亲和素连接的辣根过氧化物酶检测或是借助于链霉亲和素连接的珠子进行分离，可用于快速检测哺乳动物细胞中的脂肪酸酰化修饰。该法与氚化脂肪酸代谢标记方法相比，灵敏度甚至可提高6个数量级。

1.4 以炔基为化学报告基团的方法

炔基可保留脂肪酸碳链的疏水性，减少脂肪酸物理化学性质的变化及其与脂质问的相互作用，且具有代谢惰性。通过点击化学捕获比施陶丁格连接的效率要高，因此炔基探针通常要优于叠氮修饰的探针，具有更高的灵敏度和检测效率。

2、 “以半胱氨酸为中心”的方法

近年来普遍应用的方法是脂肪酸酰基转换标记化学法-ABE法，这种方法较棕榈酸脂代谢标记法更易于检测。该方法由Drisdel提出：先用碘乙酰胺或N-乙基顺丁烯二酰亚胺(NEM)完全封闭蛋白质Cys上所有自由巯基后，利用羟胺(HA)选择性地切开蛋白质Cys和脂肪酸修饰基团之间的巯酯键，产生新的自由巯基，再用合适的试剂如放射性标记的NEM使酰化修饰蛋白质在凝胶电泳分离后显影，或印迹后用荧光方法分析，或用具有巯基特异反应活性的试剂，如Btn-BMCC等反应，将它转化成二硫键连接的生物素，再利用avidin／streptavidin和biotin间的相互作用纯化、检测S-棕榈酰化修饰蛋白质。

此方法高度敏感，特别是巯基特异复合物标记，检测灵敏度较高，不仅应用于活细胞，还可从冻存组织中提取蛋白质标记并且能定量分析，也可联合应用探针法标记和质谱技术分析。

以上的两种经典棕榈酰化鉴定方法依然存在很多不足。“以棕榈酸盐为中心”的方法，往往需将放射性或化学修饰的棕榈酸脂类似物代谢标记到细胞内，故不能分析组织样品和体液，且较难用于癌细胞，因为癌细胞中脂肪酸合成酶的过度表达和过度活跃会极大地降低外源性长链脂肪酸的摄入。而ABE法是巯酯键特异的方法而不是S-棕榈酰化修饰特异的方法，外源性的羟胺水解敏感的巯酯键蛋白质都可能被同时富集而造成假阳性率相对较高。

小编认为目前关于棕榈酰化修饰蛋白质组研究的报道主要集中于位点的鉴定，即定性研究，且现有方法也都各有其不足之处，因此，仍需致力于棕榈酰化修饰蛋白质定性与定量分析，发展更有效及准确特异的研究方法，比如，由于棕榈酰化修饰蛋白质为细胞膜蛋白或者是与膜相关的蛋白质，疏水性强，因此可结合细胞膜蛋白质组学方法，增加膜蛋白的溶解性；现有分析方法操作步骤多，易造成样品损失尤其是低丰度蛋白质的损失，且鉴定结果的假阳性率高，因此可适当简化操作流程，选用合适的去垢剂，采用选择性好、富集效率高的新型富集载体，甚至是选用能同时满足富集和定量分析要求的富集材料，并建立相应的分析方法；发展灵敏度高、选择性好的荧光检测试剂；发展一些代谢效率更高的脂肪酸类似物等，从而提高样品分析的重复性、灵敏度和定量的准确性，以获得更多可靠的棕榈酰化修饰蛋白质及其位点的信息，甚至与活细胞成像等方法相结合，从而有助于进一步揭示动态S一棕榈酰化修饰的生物重要性和功能。

伙伴们，景杰生物官方活动“寻找实验室最特别的TA”正在火热进行，截止日期为2016年1月6日，更有购物卡等你来拿，不要错过哦！

活动信息链接请点击左下方阅读原文