“U”秀延续 - UPLC又添新成员

沃特世

2020.7.16

作者沃特世

TA的动态

上期推文中我们了解了UPLC的历史和特性，好多小伙伴更是深陷在四川、东北、上海方言Pick UPLC中久久无法自拔。但是，UPLC的优秀怎么能是一篇文章就说完的呢？今天我们继续一起揭秘UPLC在其他方面的优秀表现，你会有不一样的发现哦！

沃特世UPLC新成员 — ACQUITY UPLC H-Class PLUS Bio Binary系统发布，面向需要高灵敏度、准确度和重现性的生物分离用户，小编在此为大家介绍这款系统在肽图分析方面的表现。

图1. ACQUITY UPLC H-Class PLUS Bio Binary 系统

肽图分析在用于稳定性研究和质量控制放行检测时，紫外检测（UV）由于其固有的耐用性、简单易用和高可及性特点，是肽图分析优先选择的技术。

由于大量的肽段需要获得基线分离，通常需要以长缓梯度运行30-120分钟的色谱分离，然后基于保留时间与对照品的比对来实现对肽段的鉴别。由于色谱峰的分配依赖保留时间，在长时间内高度的色谱分离重复性对于数据解析的准确性来说尤为重要，这对色谱系统提出了挑战。

相信大家都知道采用低扩散的LC系统、更小颗粒的色谱柱可以生成更窄的色谱峰、获得更高的峰容量，同时还能缩短保留时间，小编在此就不再赘述了。

图2. 胰蛋白酶酶解物在0.1% TFA体系下的色谱图

我们先来看一下，梯度对肽图分析的影响。

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2020年新版《中国药典》四部通则3405肽图检查法中指出，肽图分离通常使用梯度洗脱体系，可根据需要选择适宜的梯度类型，对于难分离的复杂肽段混合物，可选择使用变化较缓和的梯度进行分离，方法开发中应优化梯度以获得理想的图谱，流速范围通常为0.1-2.0 mL/min。

小贴士1：放缓梯度，提高分离

图3. 梯度对反相肽图分析的影响

缓梯度有助于提高分离度：

常用的梯度是每个柱体积梯度变化1-3%；

每个柱体积变 0.25%-0.33% 时分离效果好（聚焦梯度法）。

建议分段式梯度，减少分析时间：

多肽出峰时间附近梯度需要尽量放缓；

多肽出峰较少的时间段，加快梯度洗脱。

图4. 梯度变化带来分离选择性的改变

可以观察到，缓梯度明显提高分离度，但灵敏度也会随之降低；快梯度降低了峰宽，也会降低分离度，但同时会增加灵敏度；改变梯度可以缩短分析时间，梯度变化也会带来分离选择性的变化。

小贴士2：降低流速，改善分离

由于肽段比小分子的传质更慢，对于2.1 mm内径的UPLC色谱柱，通常使用0.2 mL/min的体积流速，以达到最低的理论塔板高度，也即最高柱效点。

图5. 不同颗粒度肽段展示的van Deemter曲线

图6. 降低流速改善分离

对于难分离的复杂肽段混合物，可选择使用变化较缓和的梯度进行分离，如下展示了ACQUITY UPLC H-Class PLUS Bio Binary (50 µL混合器)在流速低至0.2 mL/min时仍然表现出针与针之间的优异重现性。

图7. 低流速下，针与针之间展现优异的重现性

小贴士3：大容量混合器，改善基线噪音

肽图检查法用于常规鉴别试验，肽段通过色谱柱分离后，通常采用紫外（UV)检测器在波长200-230 nm范围内检测，常用的检测波长是214 nm。众所周知，在低波长下使用有末端吸收的流动相添加剂（如FA和TFA）时，基线波动是一个棘手的问题。ACQUITY UPLC H-Class PLUS Bio Binary配有全新设计的340 µL混合器，在连接 UV检测器时，即使用了有末端吸收的FA和TFA，基线噪声也大大改善。

图8.在0.2 mL/min流速下测定峰间噪音

小贴士4：LC-UV-MS“黄金比例”流动相，方便峰定位

通则3405肽图检查法中指出，如肽图鉴别中规定使用质谱检测器进行肽段检测，流动相可采用挥发性酸或盐以提高与质谱检测器的相容性。TFA 对质谱检测器有离子抑制作用，从而降低糖基化肽段的离子化效率，可采用甲酸、乙酸代替或与之联合使用降低离子抑制现象。

由于TFA体系会大大降低MS信号, 采用0.02% TFA+0.08% FA时，使用表面带电杂化颗粒技术CSH色谱柱，获得了优异峰容量的同时，质谱信号也远远高于紫外图谱，这对复杂峰在低含量情况下的定位非常有用。