病毒无处不在，在地球发展和人类进化中扮演的重要角色。虽然从结构上看病毒是地球上最简单的生物之一，但它如同悬在全人类头上的达摩克利斯之剑，给一代又一代人类带来灾难。日前，欧美等国的新冠疫情再度呈现上升趋势，新冠病毒的免疫研究也一直是科研热点。为此我们整理了质谱流式在病毒免疫方面的研究成果，希望为病毒研究人员提供一些参考。
当病毒通过皮肤、眼部、泌尿生殖道、消化道、呼吸道入侵人体，并突破由皮肤、黏膜及其分泌液形成的物理、化学和微生物屏障进入人体后，人体将启动自身的防御系统，对病毒进行强烈地反击。机体的抗病毒免疫分为两大类，天然免疫和获得性免疫。
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天然免疫
人类天然免疫，也称固有免疫，是人类在长期进化中逐渐形成的，是强大而有力的、抵御病毒入侵的第一道防线，这道防线的特征是无特异性，作用广泛。在这一道防线中，干扰素(IFN)应答和自然杀伤（NK）细胞占有重要的地位。
病毒进入机体后，被感染的巨噬细胞、淋巴细胞以及体细胞在识别出病毒后，将分泌干扰素分子。已有的研究表明干扰素能够阻止病毒复制、传播，也是影响病毒感染宿主种类范围的重要因素。然后，这些干扰素作为信号和交流分子被传递给周围细胞，使这些细胞激活抗病毒反应【1】。
浆细胞样树突状细胞（pDC）是产生“天然”干扰素α（IFNα）的细胞。因为DC细胞数目稀少且异质性高，所以有关肝脏pDC功能的基本问题和制造细胞因子的能力仍然没有答案。Doyle等用质谱流式分析显示在HCV感染后，肝脏pDC是唯一在TLR-7/8（Toll样受体）刺激反应中产生大量IFNα的肝脏单核细胞【2】。因此，多功能肝pDC可能是慢性HCV感染期间炎症和的免疫激活的主要驱动因素。斯坦福大学医学院的研究人员使用38个参数的质谱流式实验检测9位供体的H1N1和H3N2型流感病毒感染的单核细胞中NK细胞配体表达水平的变化，以此来确定NK细胞对流感感染单核细胞的差异反应中可能存在的受体-配体相互作用。该研究表明在T细胞缺失的情况下，流感病毒依赖于细胞因子和受体-配体相互作用的信号来触发NK细胞分泌IFN-γ，并加以调控，以此实现免疫逃逸的策略【3】。这些研究表明IFN应答在保护宿主免受病毒入侵方面起着至关重要的作用。
自然杀伤（NK）细胞是一组多样化的先天淋巴细胞，专门对病毒感染细胞或癌细胞作出快速反应【4】。NK细胞通过一系列的受体来介导对病原体的应答。抑制性受体如杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIRs)和异源二聚体NKG2A-CD94等保护健康细胞免受NK细胞的攻击，而NKp46, NKp30, NKp44, NKG2C等激活受体则是NK细胞“改变自我”的信号【5】。这些激活和抑制受体共同决定了NK细胞成熟的程度和对刺激的反应程度，这种单细胞水平上表达模式的变化导致了NK细胞的高度多样化。
NK细胞也被认为在控制艾滋病毒感染方面发挥作用，但是它们的作用尚不明确。Pohlmeyer等采用质谱流式技术同时检测不同HIV感染者外周血NK细胞24种表面标志物的表达水平，通过两种机器学习的方法，研究发现CD56dimCD16+NK细胞的CD11b+CD57-CD161+Siglec-7+亚群可能在HIV感染后的免疫控制过程中起到非常重要的作用【6】。Kurioka等用质谱流式技术则发现NK细胞CD161的表达可能参与炎性疾病的发病机制，并与T细胞和NK细胞对细胞因子的先天应答相关【7】。
除了干扰素和NK细胞外，吞噬细胞、中性粒细胞及补体系统也在固有免疫反应中发挥着重要的作用。这些非特异性免疫是机体的第一道免疫防线，也是特异性免疫的基础。
02—
获得性免疫
很多病毒被第一道防线防御和杀灭，但是也有些病毒在斗争中不断增强技能，要么快速、大量的复制，要么产生新技能“绕过”防线。当病毒逃脱了固有免疫防线之后，就面临着免疫系统的第二道防线——获得性免疫。
获得性免疫又称特异性免疫或适应性免疫，是人体经后天感染（病愈或无症状的感染）或人工预防接种（疫苗、类毒素、免疫球蛋白等）而使机体获得的抵抗感染能力。获得性免疫分为体液免疫和细胞免疫。
负责体液免疫的是B细胞，机体在对抗病毒的过程中可产生特异性的抗体，其中中和抗体可与病毒表面的抗原决定簇相结合，使病毒失去吸附和传入的能力，从而预防感染蔓延。有些抗体则可以帮助补体标记病毒，利于吞噬细胞吞噬。
与体液免疫相对应的细胞免疫，是指狭义的细胞免疫，仅指T细胞介导的免疫应答，即T细胞受到抗原刺激后，分化、增殖、转化为细胞毒性T细胞。细胞免疫不仅有细胞毒性T细胞对靶细胞的直接杀伤作用，也有通过细胞因子招募其他免疫细胞对抗原进行吞噬、杀伤、清除等功能，还有记忆功能，对再次入侵的相同病毒可直接起到杀伤作用，是机体最有效的防御手段。
质谱流式在获得性免疫研究方面也起到的推动作用。斯坦福大学的Nair等在轮状病毒的的研究中采用质谱流式技术同时分析在肠和循环B细胞中与分化和转运相关的34个标志物的表达情况，后续通过数据分析阐释了B细胞组成的异质性以及B细胞主要亚群的相互关系。此研究用一种新的分辨率展示了B细胞的复杂性，并且从一个新的角度揭示了机体针对重要的黏液病毒体液免疫记忆的调控机制【8】。Eccles等人通过质谱流式技术对24名鼻病毒感染者的研究发现，T-bet+记忆B细胞的两种亚群与免疫系统感染消除鼻病毒，并在再次感染鼻病毒有关【9】。来自美国La Jolla免疫学研究所的研究人员，用质谱流式技术结合转录组和TCR分析手段发现在登革热抗原刺激后，登革热病毒特异性CD8+ T细胞主要分为2大类亚群，一类是CD45RA−CCR7−效应记忆(Tem) T细胞亚群，另一类是CD45RA+CCR7−效应记忆 (Temra)T细胞亚群，这两类细胞亚群有着各自特殊的表达谱，并且这两类特殊的T细胞亚群有独特的T细胞受体【10】。这些研究为病毒致病机理的探索及疫苗的研究提供了参考。
小结：
综上所述，质谱流式已经大量应用于病毒免疫相关的研究领域。知己知彼，才能百战不殆。质谱流式由于其高通量、超多参数的技术特点将从新的角度，以更高的分辨率来阐释病毒免疫的相关问题。
参考文献：
[1] Principles of Effective and Robust InnateImmune Response to Viral Infections: A Multiplex Network Analysis. Huang Y, Dai H, Ke R Front Immunol. 2019 Jul24;10:1736. doi: 10.3389/fimmu.2019.01736.
[2] Individual liverplasmacytoid dendritic cells are capable of producing IFNalpha and multipleadditional cytokines during chronic HCV infection. Doyle EH, Rahman A, AlomanC, Klepper AL, El-Shamy A, Eng F, et al. PLoSPathog 2019; 15(7):e1007935.
[3] Differential induction of IFN-α and modulation of CD112and CD54 expression govern the magnitude of NK cell IFN-γ response to influenzaA viruses. Kronstad, L.M. et al.Journal of Immunology 201(2018): 2,117–2,131.
[4] Natural killercell diversity in viral infection: Why and how much? Blish, C.A. Pathogens and Immunity 1(2016): 165–192.
[5] Pregnancy-Induced Alterations in NK CellPhenotype and Function. Le Gars M, etal. Front Immunol. 2019 Oct 23;10:2469. doi:10.3389/fimmu.2019.02469. eCollection 2019.
[6]Identification of NK cell subpopulations that differentiate HIV-infected subjectcohorts with diverse level of virus control. Pohlmeyer, C.W. et al. Journalof Virology(2019): e01790-18.
[7] CD161 defines afunctionally distinct subset of pro-inflammatory natural killer cells. Kurioka,A. et al. Frontiers in Immunology 9 (2018): 486.
[8] High-dimensional immune profiling of total and rotavirusVP6-specific intestinal and circulating B cells by mass cytometry.Nair,N. et al. Mucosal Immunology 9 (2016): 68–82.
[9] T-bet+ Memory B Cells Link to Local Cross-Reactive IgG uponHuman Rhinovirus Infection Eccles JD, etal. Cell Rep.2020 Jan 14;30(2):351-366.e7. doi: 10.1016/j.celrep.2019.12.027.
[10] Dengue-specific CD8+ T cell subsets display specializedtranscriptomic and TCR profiles. Tian, Y. et al. Journal of ClinicalInvestigation 129 (2019): 1,727–1,741.
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