Molecular Cancer| 重庆医科大学陈俊霞团队揭示circACTN4促进乳腺癌发生发展的新机制

吉凯基因

2021.6.24

作者吉凯基因

TA的动态

在大多数国家，乳腺癌已成为女性发病率第二高的癌症。在全球范围内，2018年新诊断乳腺癌约210万例，约占所有女性恶性肿瘤病例的25%，因此，迫切需要寻找新的治疗靶点和治疗策略。环状RNAs (circRNAs)是近年来应用高通量测序在很多物种中广泛发现的一类新的RNAs。circRNA在不同的病理情况下显示出疾病特异性和发育阶段特异性的特征，这表明circRNA可以作为新的潜在的生物标志物用于诊断和治疗。越来越多的证据表明，表达失控的circRNAs参与了乳腺癌的进展。

6月11日，重庆医科大学陈俊霞教授团队在国际著名肿瘤学期刊Molecular Cancer 杂志在线发表题为“The circACTN4 interacts with FUBP1 to promote tumorigenesis and progression of breast cancer by regulating the expression of proto-oncogene MYC”的文章，团队中研究生王晓松作为本篇文章第一作者。报道发现circACTN4在乳腺癌中高表达，并通过结合FUBP1调控myc的转录与表达，从而促进了乳腺癌的发生发展。

研究思路和方法

circACTN4的鉴定

作者通过微阵列分析筛选出高表达的环状RNA hsa_circ_0050900 (circACTN4),荧光原位杂交以及核质分离实验检测其主要定位于细胞核。相对于线性基因，circACTN4更加耐受放线菌素D和RNA酶 R消化。随后通过生物信息学预测、双荧光素酶报告基因和染色质免疫沉淀(ChIP)实验证明转录因子USF2与ACTN4的启动子区域结合，促进ACTN4转录。构建USF2的过表达和干扰质粒，证明USF2可以促进线性ACTN4以及circACTN4的表达。

图1. circACTN4在乳腺癌中的验证和鉴定

circACTN4的表达

与临床病理分期的关系

qRT-PCR结果显示circACTN4在乳腺癌组织中显著高表达；ROC曲线显示circACTN4的表达可以作为乳腺癌的诊断指标；此外，circACTN4在乳腺癌细胞(MCF-7、SK-BR-3)中显著高表达；作者又利用乳腺癌组织芯片(TMAs)来测定ISH对circACTN4的表达，结果显示circACTN4高表达的患者总生存期更短。且circACTN4的表达与T期、N期、TNM期正相关。

图2. circACTN4在BC中表达上调，

与BC患者病情进展及预后不良相关

circACTN4可促进BC细胞增殖，

调节BC细胞凋亡

作者构建circACTN4的过表达载体和小干扰质粒，通过qRT-PCR进行转染效率验证。随后通过平板克隆、EdU以及CCK-8等功能实验验证circACTN4可以促进乳腺癌细胞增殖。Hoechst 33342染色、流式细胞术以及western blot等实验验证敲低circACTN4可以促进乳腺癌细胞凋亡。

图3. circACTN4可促进BC细胞增殖，

抑制BC细胞凋亡

circACTN4促进细胞的迁移和侵袭，

并调节细胞周期进程

细胞划痕、小室侵袭和迁移等一系列实验结果显示circACTN4可以促进细胞的侵袭和迁移。随后作者用western blot检测转移相关蛋白nm23-H1、MMP9、MMP2蛋白水平，结果显示MMP9、MMP2蛋白水平与circACTN4表达呈正相关，而BC细胞中过表达circACTN4后，nm23-H1蛋白水平下调。流式细胞术和western blot实验检测结果表明敲低circACTN4可以调节乳腺癌细胞周期的进程。

图4. circACTN4促进BC细胞的迁移、

侵袭和细胞周期进程

circACTN4与FUBP1相互作用，

激活MYC转录

为了探索circACTN4的分子机制，作者通过pull down联合质谱分析以及RIP实验验证circACTN4与FUBP1相互结合，且circACTN4和FUBP1在细胞核中共定位。作者发现circACTN4的水平变化并没有改变FUBP1的表达水平，表明circACTN4没有参与FUBP1的翻译后调控。qRT-PCR、western blot和 Pearson相关分析结果证明FUBP1明显促进MYC在乳腺癌细胞表达水平且FUBP1在乳腺癌组织的表达明显高于邻近的正常组织，并且circACTN4的水平与BC组织中FUBP1的表达呈正相关，MYC在BC组织中高度表达且与FUBP1的表达呈正相关，circACTN4与 MYC在乳腺癌中的表达正相关，circACTN4可以促进MYC和其下游蛋白CDK4 ,CCND2的表达。

图5.circACTN4可以与FUBP1结合，

上调MYC的表达

circACTN4和FIR竞争结合FUBP1

为了验证circACTN4和FIR是竞争关系的假设，通过qRT-PCR检测结果表明FIR的表达在乳腺癌中明显下调。Pearson相关分析显示，在BC组织中FIR的表达与circACTN4、FUBP1、MYC水平呈负相关。随后，作者通过Co-IP和一系列ChIP实验验证了circACTN4与FIR是竞争性结合FUBP1的。此外，作者通过qRT-PCR和western blot结果发现，FIR的水平与MYC的水平相反。最后，作者通过共转染后的qRT-PCR结果发现，过表达FIR可以逆转circACTN4对MYC表达的增强作用，而敲低FIR可以抵消circACTN4下调对MYC表达的抑制作用。

图6. circACTN4阻断FUBP1与FIR的结合

FIR逆转circACTN4

在BC细胞中的促肿瘤作用

作者通过质粒共转染进行一系列的挽救实验，验证circACTN4是否通过circACTN4/FUBP1/MYC轴发挥生物学作用，结果表明，FIR过表达可显著逆转circACTN4上调对BC细胞增殖、迁移和侵袭的促进作用。此外，IF实验也显示过表达和敲除FIR可以明显逆转circACTN4上调和下调对MYC表达的影响。western blot分析显示，FIR可以逆转circACTN4对MYC及其下游蛋白CDK4和CCND2表达的促进作用。

图7. FIR逆转circACTN4在BC细胞中的致癌作用

circACTN4促进体内异种移植瘤

的发生和转移

进行一系列体内实验，结果显示过表达circACTN4组移植瘤的体积和重量明显大于对照组。此外，与对照组相比，circACTN4上调明显增加了转移性肺结节的数量，且circACTN4可显著促进肿瘤血管生成。western blot结果显示，过表达或沉默circACTN4组移植瘤组织中MYC蛋白水平显著升高或降低。生物发光结果显示circACTN4过表达增强了乳腺癌细胞在裸鼠体内的增殖和转移。此外过表达circACTN4组小鼠总生存率更低，肝转移更广泛。最后，我们通过免疫组化的方法确定了circACTN4促进靶蛋白MYC、下游细胞周期相关蛋白CDK4和CCND2以及细胞增殖相关蛋白Ki67的表达。