水溶性维生素的同时分析

维生素是生物体代谢所必须的微量元素，大多为人体不能自己合成的物质，所以需要从食品中摄取。近年来，以营养补给为目的的，添加了维生素成分的加工食品和饮料越来越多。特别是满足一日所需维生素的复合加工食品，非常受欢迎。

维生素的分析方法，以前使用微生物学定量法、吸光光度法以及HPLC的方法。由于维生素种类繁多，需要花费大量的时间和手续。而且，使用HPLC方法进行多种水溶性维生素的定量时，多数使用ODS色谱柱配合离子对试剂的方法。此种方法容易造成离子对试剂在设备中残留，使背景升高，灵敏度降低等问题。本实验室使用聚合物基质反相色谱柱Shodex RSpak DE-413L(4.6mm I.D.×250mm；4μm）和它的保护柱Shodex RSpak DE-G 4A（4.6mm I.D.×10mm；10μm），不使用离子对试剂，进行水溶性维生素的同时分析。下图为各种水溶性维生素的结构图。本实验使用市售的复合维生素保健品进行定量。

使用市售的硫酸铵，盐酸吡哆醇，烟酰胺，抗坏血酸，烟酸，泛酸钙，氰钴胺素，叶酸，核黄素和生物素作为标准样品。生物素使用4mM的浓度，其他维生素使用2mM的浓度作为标准样品，用250mm的磷酸水溶液溶解作为标准原液。然而，由于叶酸，生物素，核黄素在酸性溶液中难以溶解，可以先使用10％氨水溶液事先溶解，再用10mM的磷酸溶液制备。通过适当混合每种标准原液并用250mM磷酸水溶液稀释来制备校准曲线的标准溶液。高浓度磷酸水溶液用作稀释溶剂的原因是为了抑制抗坏血酸的氧化。由于高浓度的叶酸配置原液时，可能产生数小时不溶解的现象，为了避免这种现象产生，可使用的最高浓度为20μM。

2.样品的配制

选取市售片剂复合维生素补充剂1粒（210mg），添加5mL250mM的磷酸水溶液，超声处理，作为原液。取一部分原液中的浑浊部分，200倍稀释，超声处理。原液稀释200倍，离心分离（10000rpm*5min），除去不溶物，上清液用0.5μm的膜过滤，作为测试样品。由于补充剂中维生素的浓度各异，所以把原液稀释200倍使用。另外，分析叶酸的时候，请按照如下步骤处理。取10mg研磨成粉末状的维生素补充剂，加50μL10%的氨水，超声处理。再加入含有10mg/mL抗坏血酸的250mM磷酸水溶液定容至5mL。添加抗坏血酸是为了防止叶酸的氧化。然后同样使用超声处理后离心分离，上清液过0.5μm滤膜，作为测试溶液。

1.标准样品的谱图及检量线

测试波长为254nm，但是由于泛酸和生物素在254nm处灵敏度低所以使用210nm波长。所有的种类都得到了R2>0.999的高直线性的检量线。本实验方法只是用磷酸水溶液和乙腈作为流动相，20分钟内就能对10种维生素进行同时分析。（包含色谱柱平衡时间）

2.市售维生素补充剂中的水溶性维生素成分的含量

谱图如下。

尽管生物素在210nm处与其他组分重叠，但在较低波长的190nm处检测到几乎单个峰。然而，由于在峰的后半部分略微观察到其他组分的影响，因此基于峰高而不是峰面积进行定量测定。峰高校正曲线（相关系数R2 = 0.9972），线性度也相对较好。

下表为市售维生素保健品种水溶性维生素的定量结果

确立了使用Shodex RSpak DE-413L同时分析10种水溶性维生素的方法。流动相使用磷酸水溶液和乙腈的混合溶液，可以在20分钟内完成分析。

检量线直线性好，检测实际市售样品也可以定量。

RSpak DE系列由于是聚合物基质，和硅胶基质相比，即使是含水率非常高的流动相条件下，也不易裂化，可以实现稳定分析。