外泌体/铁死亡——多热点如何应用于肿瘤研究

国自然的多热点联合，会碰撞出什么样的火花呢？小编今天将和大家分享近两年国自然研究中一直持续火热的两大研究热点：铁死亡和外泌体，将以2篇文献解析的形式了解多个研究热点是如何配合进行机制研究的。

综合近5年的国自然的中标基金项目金额和项目数可以看出，铁死亡和外泌体的课题研究热度持续上升，并且多聚焦在肿瘤、神经、中医药等学科领域。

注：作图数据来源于MedSci

为了提高科学研究的创新性，很多老师采取多热点联动的策略不失为创新点和小小的捷径，为此小编和大家分享如下2篇研究，获得一些启迪。

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铁死亡是依赖于细胞内铁的累积而引起毒性脂质过氧化物ROS升高的非凋亡细胞死亡形式。肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)可以通过分泌包括外泌体在内的多种生物活性物质促进肿瘤进展和耐药性。然而CAFs在调节肿瘤细胞脂质代谢和铁死亡中的作用仍未可知，基于此作者开始了这篇研究。

1. 在肿瘤进展、化学治疗等条件刺激下，CAFs细胞中的异质核糖核蛋白A1（hnRNPA1）在泛素特异性蛋白酶7（USP7）作用下去掉 “死亡标签”Ub而稳定存在；

2. hnRNPA1与胞内的miR-522互作，并作为 “蛋白支架”以外泌体形式被运送至旁边的GC cells中，引起GC中miR-522的上调;

3. miR-522可以和ALOX15的mRNA结合下调ALOX15蛋白（参与脂质过氧化的调控），引起脂质ROS的降低，最终导致铁死亡的抑制。

图1-1：作用机制模式图

● 目的基因的筛选：蛋白组学LC-MS/MS

质谱分析癌和癌旁中差异表达的蛋白，并筛选出与铁死亡通路相关的差异表达变化较大的基因作为候选目的基因，并通过WB、qPCR、IHC验证此差异性，结果发现参与铁死亡调控的蛋白ALOX15于癌中较癌旁低表达，且高表达ALOX15的患者其总生存期较长，从而提示ALOX15可能作为GC中一种抗癌因子。

图1-2：差异基因筛选和验证

● 外泌体检测：电镜、WB、NTA、外泌体吞噬

作者分离并鉴定了正常和癌症病人中的血清外泌体，并发现miR-522在肿瘤患者的血清和肿瘤样本中都呈高表达。且发现正常癌旁样本中高丰度的细胞群NFs较肿瘤相关成纤维细胞CAFs、原代肿瘤细胞（TC cells），其分离得到的外泌体更多，且miR-522在CAFs中丰度更高。

图1-3：外泌体抽提和鉴定

● 铁死亡检测：细胞死亡、线粒体膜蛋白MMP、脂质ROS含量

胃癌细胞SGC7901和MKN45作为细胞模型，发现CAF外泌体可以逆转在铁死亡诱导剂Erastin作用下的细胞死亡和ROS累积，而CAFs外泌体中去除miR-522后，此逆转效应消失，从而证明CAFs来源的miR-522可以通过抑制铁死亡促进肿瘤细胞增殖，如图1-4。

图1-4:CAFs分泌的外泌体抑制GCs细胞的铁死亡

从而说明CAFs通过分泌外泌体miR-522，靶向ALOX15，阻断脂质-ROS积累，抑制癌细胞的铁死亡。从而揭示GC通过USP7、hnRNPA1、exo-miR-522和ALOX15信号通路获得性耐药的新机制。

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外泌体作为体内的“小信差”可以携带miRNA到受体细胞影响其增殖和化学抵抗，作者希望探究外泌体来源的miRNA是否参与调控非小细胞肺癌顺铂耐药株的敏感性。

通过生物信息学分析和荧光素酶检测，确认METTL3是miR-4443的直接靶基因。进一步的机制分析表明，miR-4443通过METLL3以m6A方式调控FSP1的表达。

● 外泌体检测：电镜、NTA、WB、外泌体吞噬

图2-1：敏感和耐药肿瘤样本中外泌体的鉴定和吞噬

首先作者从肿瘤样本中分离到了外泌体，并通过检测外泌体的形态 (图2-1 A)、大小（图2-1 B）、分子指标（图2-1 C左）、外泌体吞噬（图2-1 C右）确认所抽提外泌体的质量，并通过PKH67标记确认外泌体可以进入到顺铂敏感株（Cis-S）和耐药株（Cis-R）中。

结果发现顺铂敏感的肿瘤组织（Cis-S）中的miR-4443较对照组织表达低，而顺铂耐药的肿瘤组织（Cis-R）中表达最高，大概有5倍的差异，细胞中得到相同的结论。并且发现，外泌体来源的miR-4443可诱导受体细胞产生顺铂耐药性。

● 铁死亡检测：细胞活力、ROS、Fe²⁺、WB（FSP1，抑制铁死亡）

图2-2：miR-4443促进细胞铁死亡

由以上的铁死亡指标检测可知miR-4443可通过诱导顺铂敏感株的铁死亡。为更一步证实此结论，作者通过添加铁死亡相关诱导激活剂（Erastin）、抑制剂（Fer-1）检测顺铂刺激条件下铁死亡的相关指标，如图2-2：细胞中Fe2+、脂质ROS、线体体中SOX（图2-3 D）以及WB（FSP1），发现miR-4443可以上调铁死亡抑制剂FSP1,抑制细胞铁死亡。

图2-3：Cisplatin诱导A549敏感株细胞的铁死亡

那么miR-4443对于FSP1的调控是如何实现从而影响铁死亡的呢？生信分析发现METTL3这个甲基化转移酶是miR-4443的下游靶标，并且通过双荧光素酶实验证实了miR-4443可以和METTL3的3’UTR结合，从而调控METTL3的翻译，如图2-4。

图2-4：双荧光素酶实验

生信分析后发现，FSP1 mRNA有5个m6A sites，位置分别是2270, 2413, 4241, 4245 和16006（图2-5 B），从而提示可能FSP1通过m6A修饰影响其蛋白的翻译。通过检测敏感细胞株和药物抵抗细胞株中的总体m6A修饰后发现，miR-4443显著抑制了整体m6A修饰，并且过表达miR-4443后发现，A549敏感株细胞中FSP1的m6A修饰显著降低；添加miR-4443抑制剂后，A549药物抵抗株中的FSP1的m6A修饰显著升高（图2-5 C）。

综上miR-4443通过METTL3/FSP1介导的铁死亡通路在NSCLC中的顺铂耐药中发挥重要作用。

图2-5：miR-4443参与调控FSP1的m6A修饰

关于铁死亡研究中需要检测哪些指标可以点此参阅

外泌体研究中需要检测哪些指标

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