【精彩回顾】丹纳赫生命科学沙龙：核酸药物的修饰、递送和工艺开发

2021年12月22日，丹纳赫生命科学再次携手医麦客开展了主题为《核酸药物的修饰、递送和工艺开发》的精彩沙龙。

新冠疫情推动了核酸药物的开发，使其成为了现在最热门的投资领域。在这个领域里，最早的小核酸技术凭借其特异性、高效性和长期优势成为了热门赛道。

国内对寡核苷酸领域存在一定误解，从分子量来看，寡核苷酸居于小分子与大分子之间，与传统的小分子化药或者抗体药物相比，核酸药物虽然看起来制备工艺比较简单，但是每一个环节都存在较大差别。

威立特尔生物医药科技公司成立于2019年7月，专注于寡核苷酸的开发（AD）、工艺开发（PD）和GMP的生产，年产可以达到15公斤到20公斤。

时间就是金钱，早期AD、PD的实施对不纯物的把握、分析方法的固定和工艺优化的完整把握至关重要，这一点与小分子截然不同。例如合成，如果仅仅是合成之后再进行纯化处理，那么有时就会是不可能完成的任务。

早期工艺中R&D的目标是拿到产品，而到PD的概念完全不同，在R&D得到的所有合成的数据，到PD时毫无意义，这也是与小分子和抗体药物的明显区别。寡核苷酸领域的特色就是R&D进程很快，而一旦到申报时，进行PD的时间往往不够，需要花费更多的时间和精力。

修饰核苷酸在mRNA中扮演着不同功能：保证mRNA的正常表达（m7G，3’om-m7G）、降低mRNA自身的免疫原性（m6A，m5C，s2U，Ψ…）、提高mRNA的稳定性（Ψ，m1Ψ）、提高mRNA的表达效率（Ψ，m1Ψ）等。

mRNA极其不稳定，并且含量少，提取与合成极其困难，因此早期关于mRNA的成药可谓是天方夜谭，而BioNTech的Katali Karikó和宾夕法尼亚大学的Drew Weissman通过应用修饰核苷酸使mRNA的成药成为可能。

Pesudouridine和N1-Me-Pesudouridine是mRNA成药的基础，新冠疫情的出现更是促进了这一技术的转化，BioNTech/Pfizer与Moderna的mRNA COVID-19疫苗保护率都高达95%以上，震惊世人。但是，Pesudouridine和N1-Me-Pesudouridine价格高昂，并且专利基本已被国外垄断。因此我们应该在核苷酸方面创造更多选择，不同的细胞系、不同的靶点应该有不同的核苷酸，在不同的序列中选择不同的核苷酸，有时反而可以达到意想不到的效果。

吉量核酸早期是科研团队，较为看重mRNA的质量。修饰核苷酸作为吉量核酸的核心产品之一，依据国际标准进行质量检测和质量控制。

国际品质：产品纯度可达99%以上，且批次间质量稳定

无动物源成分：合成过程中不引入动物源成分，降低病毒污染风险

无污染：每批次产品均通过DNA酶、RNA酶及内毒素检测，确保产品合成过程未引入外源无污染

表达效率保证：产品经过转录测试和表达测试，转录活性和表达活性优于同类产品

工业级产能：修饰核苷酸产能可满足工业级应用，满足核酸药物从药物开发到工业级生产的不同需求

5-Me-CTP是在表观遗传学中常用的核苷酸，在每个人体内大量存在。这种核苷酸容易合成，因此成本较低。2006年，Kariko与Weissman的研究认为5mC可以降低mRNA的免疫原性，但是仅仅降低免源性是不够的；随后Tasuku Kitada研究组认为5mC与N1-Me-Pseudouridine相互配合可以产生协同效应，显著增强某些哺乳动物细胞内mRNA的表达强度并延长表达时间。

促进mRNA的表达并不仅仅与免疫原性和稳定性有关，与二级结构也有相关性。2019年，Moderna与Stanford联合研究表明在某些特定的靶点和序列中，5-Mo-U修饰可能可以通过改变mRNA二级结构的方式提高表达强度。

此外，吉量核酸可能是国内唯一家提供高纯度、高活性的4-Acetyl-CTP原料的团队。

不同于一般的非修饰核苷酸，修饰核苷酸往往采用的是化学合成与生物合成相结合的方法进行生产，纯化困难且稳定性差。脱磷酸产物往往是导致转录产率降低的直接原因，并且合成中产生的杂质会强烈抑制T7酶活性导致转录完全失败，或者序列保真性降低。因此除了酶之外，原料也非常重要。

吉量核酸具有丰富的mRNA优化、合成、表达经验，可以提供全方位的技术支持。

在核酸药物研发过程中面临很多挑战：如何缩短药物的开发时间，如何通过开发更多有效检测方法加速药物筛选和表征的分析。

毛细管电泳技术具有：擅长极性/带电物质的分离、提供更高的分辨率、样品制备和分离速度快、样品和试剂消耗少的特点。

毛细管电泳技术的分离对象集中在热门生物药的领域，如：蛋白、核酸等分析，而实际应用的方向也主要集中在这些方面。毛细管电泳技术在蛋白分析：如单抗、多抗、融合蛋白等蛋白药物产品上的应用都已趋于成熟。

毛细管电泳对核酸的应用主要是一代测序及PCR产物的分析，近两年延伸到核酸药物方面，其主要是依据核酸的分子量大小或者空间构型的差异对核酸进行分离。SCIEX毛细管电泳仪配备了两款不同的检测器，紫外检测器可以根据核酸的特征紫外吸收波长进行检测，而对于含量比较小或者对分离度要求较高的核酸，则可以使用激光诱导荧光检测器（LIF）。

SCIEX的毛细管电泳仪在基因/细胞治疗分析中的应用有以下几点：

1.质粒的纯度分析

2.DNA酶切产物的鉴别

3.基因组完整性分析

4.宿主细胞残留DNA 的分布分析

在mRNA疫苗分析中的应用有以下几点：

1.mRNA完整性分析

2.mRNA加帽效率分析

3.mRNA poly A尾巴分布分析

总结来看，SCIEX的毛细管电泳仪在核酸分析的应用主要还是集中在双链及单链的核酸药物，张晓霞所述案例主要使用了激光诱导荧光检测器，分离缓冲液可使用SCIEX的试剂盒，也可以自配，其方法在节约试剂成本的同时提高了分离度及灵敏度。

外泌体的应用领域非常广，从肿瘤的诊断，到药物的开发。外泌体能通过血脑屏障，同时跟人体的细胞比较相似，因此具有极大的递送优势。此外，外泌体具有免疫原性低的特点，同时外泌体的表面蛋白能够提高递送的靶向性，这使得外泌体成为核酸药物递送载体的首要选择。

传统的基因治疗方式，是对人类DNA插入或添加一个DNA分子，带有特定的“设计”指令，并由细胞“翻译”为蛋白质。

与基因疗法相比，mRNA技术不会影响DNA的结构，而且随着时间的推移会被细胞分解，所以它的副作用能够得到更精确的控制。

在mRNA疗法中最核心的环节就是递送，如何将mRNA精确而且有效的递送到受体细胞中，是目前研究mRNA疗法的研究团队都在思考和突破的挑战。

目前mRNA递送系统包括脂质体、纳米脂质体、脂质复合体、多聚体、脂质纳米颗粒、以及外泌体。其中，外泌体被认为最具有潜力去解决小核酸药物在体内递送的瓶颈，因为外泌体具有更低的免疫原性和毒性，更好的跨细胞和组织屏障能力，以及实现更高效的细胞传递的潜力。同时外泌体还能保持结合靶向分子和装载内源性和合成RNA cargo 的可能性。

外泌体作为递送系统它是如何实现的呢？首先把外泌体从供体细胞中分离，然后经过纯化得到外泌体颗粒，把mRNA等装载到纯化的外泌体中，最后递送到受体细胞。

外泌体携带蛋白质、RNA、DNA、脂质等，传递细胞间信息，可以对受体细胞的表型效应产生影响，发挥表观遗传调控的作用。

在对外泌体分离纯化之后，通常根据外泌体的物理特性、生化组成或者细胞来源，对其进行表征分析。传统的批量分析如：Western blot, ELISA；qPCR, NGS等，单颗粒分析如：Electron microscopy, cryo EM, AFM；Nanoparticle tracking analysis；Resistive pulse spectroscopy等。

尽管有如此多的方法，可每个方法仍存在局限性。目前，这些应用仍然受到细胞外囊泡固有的异质性和无法获得完全表征的纯细胞外囊泡群的限制。

而随着外泌体生物学领域的不断研发，出现了能够更好地对外泌体进行分离和表征的技术，从而能够更好的去了解它的一个生物学特性，使其能够与临床相结合，具有更大的临床意义，这也是流式细胞术所带来的益处。

流式细胞术是一种有效的定性、定量、分选和纯化悬浮颗粒的方法。但是流式细胞术的使用也受到一定的限制，如：颗粒光散射与背景噪声的重叠，大量颗粒(尤其是小颗粒)仍未被常规流式细胞术识别。而贝克曼库尔特的流式细胞分析仪CytoFLEX系列和分选仪CytoFLEX SRT、MoFlo Astrios EQ可通过VSSC或增强型前向检测器实现小颗粒的检测。

此外，侯丽芳还举例介绍流式细胞术用于分析和分选外泌体的实例，如采用Beckman Coulter的CytoFLEX SRT分选仪分选血小板外泌体，并展示了MoFlo Astrios EQ/EQs仪器对小颗粒的高灵敏分辨率。