恒光讲堂｜近红外二区NIR-II发光AIEgen光敏剂使超灵敏的成像引导手术和光疗能够完全抑制原位肝肿瘤

恒光智影

2022.1.13

作者上海恒光智影医疗科技有限公司

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本文要点：原发性肝肿瘤的准确诊断和有效治疗具有重要意义，光学成像已广泛应用于临床影像引导下的肝肿瘤手术。第二近红外窗口(NIR-II)发射的AIEgen光敏剂以其更高分辨率的生物成像和更深的穿透性而备受关注。NIR-II聚集诱导发光物质(AIEgen)光敏剂在影像引导手术/光疗中具有更好的光疗效果和准确性。在此，本文提出了一种NIR-II AIEgen光热消融点，用于NIR-II影像引导下的原位肝肿瘤切除手术和光疗。与吲哚青绿(ICG)相比，AIEgen斑点在1250 nm处表现出明亮而锐利的近红外(NIR-II)发射，并延伸到1600 nm处，具有很高的光稳定性。此外，AIEgen DOTS有效地产生了用于光动力治疗的活性氧(ROS)。对体内和体外原位肝肿瘤的研究表明，AIEgen DOTS既可以用于早期肿瘤的影像引导肿瘤手术，也可以用于“降级”缩小肿瘤大小的意图。此外，该治疗策略完全抑制了原位肿瘤，无复发，副作用少。

方案1 NIR-II发射型AIEgen光敏剂PTZ-TQ的示意图，该光敏剂能够实现超灵敏的成像引导手术和光疗以完全抑制原位肝肿瘤

图1 a)PTZ-TQ分子的合成路线b)PTZ-TQ在四氢呋喃(THF)和水体积分数(FW)为95%的THF/H2O中的b)吸收光谱c)PTZ-TQ在THF/H2O(FW，0%~95%)中的发射d)发射强度比(I/I0),根据PTZ-TQ在不同FW下的(c)计算e)PTZ-TQ在四氢呋喃/水(FW，95%)和纯四氢呋喃中的近红外-II荧光图像f)经1%脂质体溶液检测PTZ-TQ和ICG的信号强度g)计算了PTZ-TQ的HOMO和LOMO

图2 a) PTZ-TQ-AIE点的TEM图像b)水中PTZ-TQ-AIE点的尺寸分布c)PTZ-TQ-AIE点在水溶液中的UV-Vis-NIR吸收光谱和NIR-II荧光发射光谱d)PTZ-TQ-AIE点在间歇808 nm激光(0.25W/cm2)照射60min下在PBS、FBS和DMEM中的光稳定性.e)吸光度和f)在808 nm激光(0.25W/cm2)连续照射30min下的NIR-II荧光发射g)PTZ-TQ-AIE在水中的 NIR-II荧光图像h)PTZ-TQ-AIE和ICG通过不同浓度的1%磷脂溶液的信号强度

首先，采用纳米沉淀法制备了PTZ-TQ-AIE点。透射电子显微镜(TEM)测得PTZ-TQ-AIE点的尺寸约为80 nm，动态光散射(DLS)分析测得其尺寸约为255 nm(图2A，b)，水溶液中PTZ-TQ-AIE点的UV-VIS-NIR吸收光谱和NIR-II荧光发射光谱表明，675 nm处的吸收峰扩展到900 nm，1150 nm处的荧光发射峰和发射尾部的荧光发射峰扩展到接近1600 nm(图2C)。在808 nm激光激发下，水溶液中PTZ-TQ-AIE点的量子产额(QY)为0.3%。PTZ-TQ-AIE点在PBS、FBS和DMEM介质中表现出优异的光稳定性。当用功率密度为0.25W/cm~2的808 nm激光连续照射PTZ-TQ-AIE点30min时，PTZ-TQ-AIE点的吸收和发射光谱没有明显变化(图2D，e)。此外，PTZ-TQ-AIE点在磷酸盐缓冲液(PBS)、培养基(DMEM)和胎牛血清(FBS)中的发光强度在相同密度下连续照射60min后没有变化(图2F)。PTZ-TQ-AIE斑点的光稳定性远好于商品化的ICG染料，表明PTZ-TQ-AIE斑点具有良好的体内长期荧光成像潜力。

接着，用不同的滤光片测量了NIR-IIb的荧光强度。PTZ-TQ-AIE点显示出比PTZ-TQ(FW=95%)(图2G)更好的NIR-IIa(1000-1300nm)和NIRIIb(1400-1700 nm)荧光信号。此外，在1050 nm的荧光穿透深度表明，PTZ-TQ-AIE点在8毫米的深度可以分辨出更锐利的毛细管边缘；在相同的条件下，ICG只在4毫米的深度显示出类似的分辨率(图2H)。

图3 电子顺磁共振(EPR)谱检测1O2的产生a)记录不同浓度(0~30μg/mL)的Ptz-TQ-AIE点的1O2探针的b)荧光光谱(实线：激光照射，虚线：不照射),不同时间照射下，PTZ-TQ-AIE点氧探针的c)荧光强度d)DCFH-DA诱导HepG2细胞内ROS产生e)钙黄绿素-AM(活细胞的绿色荧光)和PI(死亡细胞的红色荧光)共染色的HepG2细胞的E荧光图像f)PTZ-TQ-AIE斑点与808 nm近红外激光(0.25W/cm2)孵育24小时后对LO2细胞、HepG2细胞的体外细胞毒作用

接下来，用二氯二氢化荧光素二乙酸酯评价了PTZ-TQ-AIE点的活性氧生成能力以DCFH-DA)作为指标。在PTZ-TQ-AIE点(808 nm，0.25W/cm2)存在下，DCFH-DA的荧光随照射时间的延长而急剧增加。为了进一步验证，电子顺磁共振(EPR)被用来验证ROS的产生。在5 mm的活性氧指示剂TEMPONE与PTZ-TQ-AIE点在溶液中孵育后，然后照射5分钟进行EPR测量，当添加β-胡萝卜素时EPR信号减少(图3A)，证明了1O2的有效产生。为了了解生成的物种，首次使用单线态氧传感器绿(SOSG)来评估1O2的生成。在PTZ-TQ-AIE点(808 nm，0.25W/cm2)照射下，SOSG的荧光随照射时间的增加而急剧增加，证实1O2是主要的活性氧(图3B，c)。由于PTZ-TQ-AIE斑点具有优良的近红外发射和活性氧产生能力，因此研究了该斑点在癌症诊断和治疗中的应用潜力。如图3D所示，在辐射下，PTZ-TQ-AIE斑点加激光组显示DCFH-DA的亮绿色荧光，表明ROS的产生被有效地诱导，并通过流式细胞仪对细胞内ROS的产生进行了定量。ROS的有效产生导致细胞死亡(图3e)。然而，只有辐照或PTZ-TQ-AIE点显示出可以忽略的红色荧光，这表明PTZ-TQ-AIE点具有良好的生物相容性，单独激光照射的危害有限(图3e)。以正常肝细胞为对照，体外细胞毒性实验表明，在100μg/mL浓度下，PTZTQ-AIE dots对正常细胞和癌细胞几乎没有明显的毒性作用。3F)。此外，PTZ-TQ-AIE斑点和辐射导致细胞存活率显著降低，证明了体外光动力疗法(PDT)疗效，且PTZ-TQAIE点剂本身副作用较小。

图4 a)在尾静脉注射PTZ-TQ-AIE点后120s、300s和15min的活体长期后肢血管NIR-II成像b)根据(a)(120秒)中沿黄线测量的横截面强度剖面测量的血管半高宽宽度，峰值拟合为高斯函数c)尾静脉注射PTZ-TQ-AIE斑点后不同时间点，取原位肝癌大鼠不同时间点的活体长期近红外荧光图像，白色圆圈表示肿瘤。d）肝脏和肿瘤的图像e)NIR-II光学成像引导肿瘤切除图示f)NIR-II和生物发光成像在手术中的应用g)荷瘤小鼠的相对肿瘤生长曲线及相应的荧光强度h)肝解剖治疗后的照片

然后，为了进一步研究PTZ-TQ-AIE斑点的近红外成像和光动力学治疗能力，首次对PTZ-TQ-AIE斑点的体内生物相容性和生物分布进行了评价。给健康BALB/c小鼠静脉注射PTZ-TQ-AIE点(2 00μL，5 0 0μg/mL)后，采集血样，进行分析，主要血细胞计数无明显变化，提示PTZ-TQ-AIE点具有良好的生物相容性。PTZ-TQ-AIE斑点在肝脏和脾脏中有较高的蓄积，表明PTZ-TQ-AIE斑点的清除途径是通过肝胆系统。与ICG相比，PTZ-TQ-AIE斑点的血液循环半衰期相对较长，为61±21分钟，然后对PTZ-TQ-AIE斑点的血管成像性能进行了研究。注射后2分钟、5分钟和15分钟通过NIR-II成像可以清楚地显示血管系统(图4A)。此外，后肢血管的分辨率(711.8μm)是通过测量高斯拟合的半高宽(FWHM)(图4B)达到的，这将足以用于外科手术。

为了评价深部组织的成像和治疗，建立了裸鼠原位肝肿瘤模型。将萤火虫荧光素酶基因转染人肝细胞癌HepG2细胞，经剖腹接种于肝右叶。在确认成功建立原位肝肿瘤后，将PTZTQ-AIE斑点(200μL，500μg/mL)静脉注射到荷瘤小鼠体内。在808 nm激光的激发下，正常肝脏和肿瘤部位的NIR-II荧光被连续记录。在注射后2h，离体结果显示肿瘤部位的NIR-II荧光信号低于正常肝组织；肿瘤中较低的NIR-II信号清楚地识别了肿瘤与正常肝器官之间的边界，PTZ-TQ-AIE点在注射后48小时达到最大(图4C，注射后48h，肿瘤区域可见明亮锐利的NIR-II信号。NIR-II荧光成像的信噪比(SNR)随时间逐渐增加，48h达到最大值。为了进一步确定肿瘤的位置，在注射后96h拍摄了整个肝组织（图4D)；定位与在活体NIR-II图像上观察到的位置一致(图4C中的圆圈)。这些结果表明，在注射后2h通过负强化或在注射后48h通过正强化可以清楚地识别肿瘤与正常肝器官之间的边界。因此，PTZ-TQ-AIE点在注射后2h和48h均可用于影像引导手术，可根据肿瘤大小提供个性化的治疗选择。

鉴于PTZ-TQ-AIE点是较强的活性氧发生器，研究了PTZ-TQ-AIE点在光动力治疗中应用的可行性，以缩小肿瘤的体积，以便进一步手术切除，防止肿瘤的复发。因此，采用了不同的治疗方法：对于较大的肿瘤，先进行PDT治疗以缩小肿瘤体积，然后进行手术以最大限度地减少治疗过程中对肝脏的损伤(称为PDT+手术)；对于较小的肿瘤，先进行手术，然后对残留的肿瘤进行PDT治疗(称为手术+PDT)。治疗过程由BLI监测，用总BLI强度和相对肿瘤生长来总结不同治疗方法下的肿瘤生长情况。如图4G所示，对照组(PBS、PBS+激光和PTZ-TQ-AIE点)的BLI信号迅速增加，表明肿瘤生长速度较快。单一的治疗过程(PDT或手术)导致BLI信号显著降低，证明了单一影像引导手术或PDT在肿瘤治疗中的有效性。然而，两个单一治疗过程中的肿瘤随着时间的推移而复发(图4G中的绿色和粉红色曲线)。早期治疗取得了与单一治疗过程相似的疗效，但在观察期内无肿瘤复发(图4G中紫色和深蓝色曲线)。

最后模拟了一个不适合手术的大型肝癌模型(图4G中的紫色曲线)。在临床环境中，“降级”意图包括预处理以减小活跃肿瘤的大小或数量。首先使用PDT来减小尺寸，PDT治疗后，BLI信号在治疗后第7天急剧下降，然后进行手术以实现几乎完全的肿瘤抑制(图中紫色曲线。4G)。体内肝脏的磁共振成像(MRI)和体外照片证实，多种治疗组几乎没有肿瘤结节(图4h）。

参考文献

JiaR, Xu H, Wang C, Su L, Jing J, Xu S, Zhou Y, Sun W, Song J, Chen X, Chen H.NIR-II emissive AIEgen photosensitizers enable ultrasensitive imaging-guidedsurgery and phototherapy to fully inhibit orthotopic hepatic tumors. JNanobiotechnology.

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