多通道成像的重要性
多色或多通道显微成像在研究中常用于更好地描述疾病特征，以及更好地了解生物过程。例如在免疫肿瘤学中，有必要研究不同免疫细胞相对于关键生物标记物的位置。在神经科学中，了解神经元突触的复杂性通常需要研究多种蛋白质。在研究连通性时，必须清楚识别不同类型的神经元及其位置。
图像： 成年大鼠脑。神经元（Alexa Fluor488，绿色）、星形胶质细胞（GFAP，红色）、细胞核（DAPI，蓝色）。图像由中国广州医科大学附属第二医院神经科学研究所和神经内科徐恩教授提供。
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多色活细胞成像的成功关键因素
活细胞成像实验是了解动态过程的关键。这类实验使我们能够观察记录活体状态下的细胞，而不会可能因固定或终止不同活体过程而产生干扰性结果。在活细胞显微成像中使用多通道方法可以同步观察多个细胞结构和过程，提供生理学方面更重要的结果，从而为测量数据增加相关信息。使用单个荧光团的实验很常见，但是使用两个或多个荧光探针对活细胞成像则增加了实验难度，实验人员必须仔细考虑几个要点才能成功。
选择合适的荧光团：使用两个或多个荧光信号时，需要最大程度的减少其光谱重叠。
在生理条件下成像
成像方式：宽场显微成像通常是活细胞成像的首选。目前最常用的宽场显微成像技术使用 LED 光源和滤光片组。但是，滤光片的带宽和切换速度会严重影响采集灵敏度和成像速度，进而增加光毒性和遗漏活细胞的动态信息。
活细胞成像新方法：高光谱拆分（hyperspectual unmixing）与相量分析（phasor analysis）
视频：RPE 细胞分裂的 12 小时共聚焦延时视频，细胞稳定表达 eGFP-tubulin（青色）和 iRFP-Histone H2B（品红色）。由美国巴尔的摩约翰霍普金斯医学院荷兰实验室 C. Gliech 提供。荷兰实验室致力于研究各种控制染色体精确分布的分子机制，以及有丝分裂错误在人体健康和疾病中起到的作用。
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FluoSync：一种快速而温和的多色光谱拆分宽场荧光成像方法
FluoSync是一种使用单次曝光同时进行多通道荧光成像的精简方法。
传统的荧光成像方法通常按顺序对每个通道成像，以减少荧光团之间的串扰，或采用多光谱成像以及后续的线性拆分或基于相量的光谱拆分方法。这些方法都需要进行繁琐的手动调整或深入理解底层技术，或两者都需要。徕卡显微系统通过FluoSync引入了一种综合方法，在消除复杂性的同时保留了快速温和成像的优点。FluoSync会捕捉整个可见光光谱中的光子，与窄带宽滤光片相比，丢弃的信息更少；然后采用基于相量的混合拆分方法分离每个信号，实现可靠的通道分离。
通过比较发现，与传统荧光成像方法相比，FluoSync采集速度更快的优势显而易见。FluoSync捕捉受激发染料的全发射光谱，因此光子不会被浪费，这使它成为敏感活体样本弱光成像的理想探测技术
FluoSync充分利用了基于相量的拆分与线性拆分混合方法的优势。相量分析用于相似光谱的快速聚类以及光谱去噪和线性拆分，能够识别染料对每个聚类的单独贡献，甚至包括超过 3 种染料的情况。
图 3。左侧所示为蓝色、绿色和红色荧光团的三个单独光谱。使用相量分析时，每个纯光谱都落入相量空间中的特定空间，颜色在一个圆圈上表示，信号清晰度决定了与中心（中间面板）的距离。这些荧光团的任意组合也将落入特定空间。图中所示是三个荧光团中的每一个与所有三个荧光团的混合体的一种组合。由于任何可能的荧光团组合也将落入“它们的”空间，因此可将光谱平均化以实现去噪。右侧图是一个例子，其中黑线表示平均值 ± 误差（显示为灰色区域）。降噪光谱表示所有贡献荧光团的总和，它很好地填充了曲线下方的面积
强大的FluoSync，在捕捉显微图像信息上具有天生的优势：
可使用不同的荧光团组合更加自由地进行多通道成像：您不再受限于使用与显微镜的固定滤光镜组匹配的染料组合。
提升数据生成效率：能同时采集所有事件而无需管理多组滤光镜，从而加快了图像采集过程，提高了对多孔板等大型样本成像的效率，并且能够捕捉活体样本中的快速事件。
增强信心：使用混合光谱拆分方法意味着您无需再担心串扰。
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FluoSync | 一种快速而温和的多色光谱拆分宽场荧光成像方法
AI驱动的显微图像数据分析
图像采集完成之后，如何进行数据背后的信息挖掘又是一个老大难的问题。有数据指出，图像采集和分析是研究人员提高工作效率的主要限制因素。 最好的办法是使用人工智能和机器学习来极大程度地改进和加速图像采集和分析的进程。
如果您希望对于“多色活细胞成像”有更多的了解，欢迎关注我们的系列网络研讨会：
第一场（英文）
Leica New Imaging Technology——Get ready to enter the Microhub era
2022年3月4日 周五 | 北京时间10:00am
第二场（中文）
徕卡显微成像新技术
——欢迎进入多色同时成像新纪元
2022年3月14日 周一
10:00-10:45
内容：Get ready to enter the Microhub era（中文字幕）
10:45-11:00
内容：徕卡多模态显微成像分析中枢介绍
主讲人：赵梦路
赵梦路✦
徕卡生命科学显微镜应用专家
2017毕业于中国药科大学生物医学工程与分子影像实验室，主要研究肿瘤标志物配体亲和力，肿瘤靶向探针荧光成像、近红外成像。加入徕卡后主要负责超高分辨显微镜STED，FLIM荧光寿命检测，高端共聚焦FRAP FRET技术支持工作。同时在高端宽场显微镜THUNDER、TIRF、Scanner、激光显微切割技术方面有丰富经验。
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