肿瘤转移与肿瘤相关死亡密切相关。在肿瘤转移过程中，上皮细胞逐渐放弃其分化特征，包括失去细胞极性、细胞间粘附能力，从而获得间充质特征，如侵袭、迁移和运动，这一过程也称为上皮间充质转化（EMT）。在肿瘤进展的过程中，转化生长因子-β（TGFB）信号通路通过促进肿瘤细胞EMT转化从而促进肿瘤进展。SMAD3作为TGFB信号通路关键的蛋白分子，其甲基化在SMAD3的生物学功能不详。
近日，华中科技大学同济医学院附属同济医院王桂华教授及胡俊波教授在《The Journal of Clinical Investigation》(2021 IF:14.808)上在线发表题为“EZH2-triggered methylation of SMAD3 promotes its activation and tumor metastasis ”的研究结果。该研究探究了SMAD3的甲基化在肿瘤侵袭转移中的作用，并且阐述了靶向SMAD3甲基化在临床应用中的价值。
研究方法与结果
01. SMAD3的甲基化是TGFB1介导的SMAD3激活的关键
通过免疫印迹、蛋白质质谱、免疫沉淀等实验技术，我们发现了SMAD3的第53及第333位赖氨酸三甲基化水平在TGFB刺激下明显上调，并且进一步验证了SMAD3第53及第333位赖氨酸甲基化的缺失抑制了SMAD3的磷酸化激活。
图1. SMAD3的甲基化是TGFB1介导的SMAD3激活的关键
02. SMAD3甲基化缺失抑制了肿瘤细胞的转移能力
进一步地，我们发现了SMAD3的第53及第333位甲基化的缺失抑制了TGFB信号通路下游靶分子的表达及肿瘤细胞EMT的转化。通过小鼠肺转移模型实验，我们在体内验证了SMAD3的甲基化缺失抑制了肿瘤细胞肺转移。
图2. SMAD3甲基化缺失抑制了肿瘤细胞的转移能力
03. EZH2甲基化SMAD3的第53及第333位赖氨酸的甲基化
通过蛋白质质谱技术，我们发现了EZH2(一种组蛋白赖氨酸甲基转移酶)在TGFB刺激下与SMAD3的结合明显升高，这一发现通过蛋白质印迹技术进一步印证。进一步地，我们通过免疫共沉淀、体外甲基化等技术，验证了SMDA3的第53及第333赖氨酸的三甲基化是有EZH2所催化的。重要的是，通过构建EZH2酶失活性及激活性质粒，我们发现EZH2催化SMAD3的甲基化依赖于EZH2的酶活性。并且，我们也进一步的揭示了EZH2与SMAD3在TGFB刺激下结合增多的原因。
图3. EZH2甲基化SMAD3的第53及第333位赖氨酸的甲基化
04. EZH2促进肿瘤的侵袭依赖于SMAD3的甲基化
我们进一步地揭示了EZH2信号通路与TGFB/SMAD3信号通路在肿瘤侵袭转移中的作用。通过免疫印迹、Trans-well、小鼠肺转移模型实验，我们进一步确定了EZH2促进肿瘤细胞的转移、上皮-间质的转移依赖于SMAD3的第53及第333位赖氨酸的甲基化。
图4. EZH2促进肿瘤的侵袭依赖于SMAD3的甲基化
05. SMAD3的甲基化促进了其与膜定位分子SARA的结合
进一步地，我们揭示了SMAD3的甲基化如何促进SMAD3的磷酸化激活，通过免疫印迹、免疫沉淀、免疫荧光等技术，我们发现了SMAD3的甲基化的异常可以影响其与膜定位分子SARA的结合。
图5. SMAD3的甲基化促进了其与膜定位分子SARA的结合
06. 靶向干预SMAD3的甲基化抑制了肿瘤侵袭转移
通过构建穿膜肽偶联的小分子多肽靶向干预SMAD3的第53及第333位赖氨酸的甲基化，我们揭示了靶向干预SMAD3的甲基化治疗肿瘤侵袭转移的可能性，为进一步临床应用提供了理论依据。
图6. 靶向干预SMAD3的甲基化抑制了肿瘤侵袭转移
07. SMAD3的第53及第333位赖氨酸的甲基化是肿瘤病人预后差的分子标志
通过对肿瘤组织芯片染色，我们发现了SMAD3的第53及第333位赖氨酸的甲基化可以作为预测乳腺癌肿瘤病人预后的潜在分子标志物。
图7. SMAD3的第53及第333位赖氨酸的甲基化是肿瘤病人预后差的分子标志
研究总结
我们报道EZH2催化的SMAD3的第53及333位赖氨酸的甲基化是SAMD3在细胞膜募集、磷酸化和TGFB/SAMD3信号通路激活的关键。在机制上，我们发现了EZH2催化的SMAD3甲基化促进SMAD3与其细胞膜定位分子（SARA）的结合，而SARA又通过TGFB受体介导SMAD3的磷酸化。病理学上，我们揭示了EZH2表达增加导致SMAD3甲基化的异常高表达，从而促进SMAD3激活。临床上，我们证明了SMAD3甲基化的上调与乳腺癌中不良的生存结果明显相关。治疗上，我们通过靶向SMAD3的甲基化抑制肿瘤细胞的转移。
吉凯助力
该研究中使用的SMAD3基因敲除的病毒由吉凯基因提供，助力高效率特异性的基因敲除。
作者简介
华中科技大学同济医学院附属同济医院王桂华教授和胡俊波教授为论文的共同通讯作用，黄昌胜和胡福清为论文的第一作者，该研究得到了国家自然科学基金面上项目的支持。
（注：封面图来源于武汉同济医学院官网）
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