私享会邀请 | mRNA-LNP制备工艺考虑要素

丹纳赫生命科学

2022.5.18

作者丹纳赫

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SPTFF单向流超滤在mRNA平台应用

私享会

mRNA药物市场演变及发展方向

2021年波士顿咨询公司^【1】预计到2035年，mRNA市场规模会攀升到230亿美元，新冠疫苗的比例下降到22%，治疗性疫苗比例会达到32%，其他感染性疾病mRNA疫苗比例占到30%，治疗性mRNA药物比例约为16%。分析显示，2035年mRNA疫苗市场中肿瘤治疗性疫苗预计将占mRNA产品销售额的30%，治疗性药物的贡献接近20%。

当前mRNA药物处于持续高速发展阶段，主要可分为如下三个方向：

药物作用机制研究：mRNA具有强大的功能，可以编码不同抗体类型，针对不同靶标开发（肿瘤、传染病、罕见病等），并且可以与技术与细胞/基因治疗平台融合，具有非常广阔的前景。

新型mRNA分子结构：例如自复制mRNA与环状RNA(circleRNA)可以有效改善mRNA的应用剂量/治疗周期/药物稳定性等，是目前的一个热点方向。

不同给药方式及递送平台：皮下注射/喷剂等均在研究之列。已获批使用的mRNA疫苗均使用了脂质纳米颗粒（LNP）药物递送技术，如何突破专利屏障是众多开发者关注要点之一；此外，通过调整LNP的分子结构赋予其靶向肝部以外（如肺部）组织^【2】，也是目前值得研究的一个新方向。

尽管存在复杂的专利环境，但到目前为止已上市的mRNA疫苗均采用了脂质纳米颗粒类型的递送系统。LNP类型递送系统主要由可电离阳离子脂质、胆固醇、中性辅助磷脂和聚乙二醇修饰的磷脂组成，行业内已经出现多种细分类型，主要体现在系统成份变化及结构变化方面。

mRNA的制备工艺

到目前为止，业界进行mRNA制备的主要工艺路线如图所示，主要包括：质粒制备与线性化 ->体外转录->加帽加性-> mRNA纯化->mRNA-LNP制备->LNP纯化->LNP除菌过滤->制剂灌装。本文主要讨论后段工艺，即mRNA-LNP制备、纯化及除菌过滤过程中需要考虑的工艺要素。

图 mRNA GMP生产流程示意图

mRNA-LNP的制备

目前mRNA-LNP的制备都是通过微流控系统来完成的，微流控过程工艺参数需要考虑总流速、压力、流速比例、芯片内部结构、温度等条件。将核酸与脂质分别溶解在水相和有机相后，纳米药物制备系统推动两相溶液通过特制芯片通道，完成纳米颗粒的合成。参考脂质体的制备过程^【2】对脂质体粒径及分散度的影响，结合LNP结构具有更好的自组装性能这一特点，可以预期采用层流方式进行LNP制备可以得到更高质量的LNP。丹纳赫旗下PNI（Precision NanoSystems Inc.）的纳米药物制备系统采用层流控制技术，可以在不同规格下快速完成LNP制备，粒径及颗粒分散度(PDI)均可实现良好控制，PNI拥有一系列不同规格的微流控系统，可以满足用户从研发到GMP生产的各类需求。

图 NxGen NanoAssemblr ^® 微流控技术

NxGen 的层流混合技术可以确保形成均一，

可控和可重复的纳米颗粒。

mRNA-LNP浓缩换液

微流控技术制备好LNP后，通常需要快速稀释以降低有机溶剂浓度，以确保LNP的稳定性，此步可以直接在PNI的制备设备上完成; 之后需要采用超滤技术进行浓缩换液，充分去除有机溶剂的同时将LNP置换到制剂溶液环境中。

浓缩换液如果采用传统的切向流超滤TFF技术，无论是中空纤维还是超滤膜包，主要的潜在风险是上游料液在浓缩过程中始终在上游流路中循环，会长时间承受泵、管路和超滤设备的剪切力作用，其积累效果对LNP结构的损伤不容忽视。PALL拥有Single Pass TFF技术，通过膜结构的内部改变，使料液在膜包内单向流动一次，在回流端获得浓缩后的料液，通过增加流路长度达到浓缩效果。这种技术大幅度降低了料液循环次数，并大大降低膜包剪切力，对剪切比较敏感的LNP、蛋白、病毒等具有保护作用。已经在国内多家测试成功，采用多次稀释-SPTFF浓缩即可以成功实现LNP的换液，对mRNA-LNP结构实现了最大程度的保护。

图颇尔SPTFF单向流动模式

mRNA-LNP的除菌过滤

已报道结果^【2】说明，脂质体及LNP等纳米料级药物，由于多种因素影响，存在除菌过滤工艺中细菌挑战无法达到10^-6SAL的案例，需要慎重优化工艺、选择适宜过滤器、合理优化验证条件来确保除菌过滤工艺的顺利实现。

对此，颇尔推荐选择适宜于复杂流体的除菌过滤器，如Supor^® EKV, Supor^® ECV, Fluorodyne^® EX EDF滤器系列，这些系列共同特点之一是采用了双层膜结构，上层为不对称渐变结构，对于复杂流体具有更好的滤速与处理量；与下层对称膜结合，可以更好地实现无菌保障。

图颇尔可应用于mRNA-LNP的除菌过滤器

mRNA-LNP的小体积工艺验证

除菌过滤工艺验证中，药品使用量（常规用量为5~8L）始终是药物开发商最重要的成本，对于mRNA-LNP药物来说，这一瓶颈更为明显。对此颇尔于2022年初推出了改良后的验证方案，充分利用药物开发商已有数据，合理改进设备及试验流程，将使用药品体积缩减到165~500mL，帮助药物开发商显著降低了成本，并有可能加快药物申报或上市速度。

图颇尔常规工艺验证与小体积工艺验证所需样品量对比：

小体积工艺验证样品量只需165-500ML

除菌过滤工艺中的PUPSIT

目前国内外上市或进及临床的mRNA药物大多数为新冠疫苗或其它疫苗，这些药物的GMP生产工艺如果申请WHO预认证，需要考虑终端除菌过滤器使用前灭菌后完整性检测（PUPSIT）的应用。在GMP要求下、一次性工艺中实施PUPSIT，建议最终用户与供应商进行深度沟通，充分考虑IT检测方法、产品/水润湿、过滤器与RABS/隔离器位置、下游环境、冗余过滤等因素，并基于QbD原理及风险转移策略细致决定系统设计、使用点泄漏检测方法、验证、操作员培训等要素，从而将PUPSIT的风险降至最低，确保工艺安全。颇尔可提供从手动到全自动的除菌过滤PUPSIT设计的系统与耗材，以及相关工艺经验咨询服务。