省时省力！SPE二维液相色谱法检测乳制品中脂溶性维生素

沃特世

2022.5.19

作者沃特世

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脂溶性维生素是一类不溶于水，而溶于脂肪及非极性有机溶剂的维生素，包括维生素A、维生素D和维生素E等。维生素A、D、E是机体维持正常代谢和机能所必需的脂溶性维生素。

在婴幼儿及成人配方乳制品中，维生素A和维生素E通常添加量较高，受基质干扰较小，可直接测定。但在限定条件下难以分离维生素E的4个异构体；而维生素D的添加一般较少，紫外吸收也相对较弱，同时受基质干扰严重，所以同时测定维生素A、D、E需做两次前处理，不仅步骤多、效率低，稳定性也差。

因此，现有的国家标准方法《GB5009.82-2016》采用液质联用或半制备正相净化的方式对其进行分离检测。但是液相色谱质谱联用方法不仅操作复杂，维护成本相对昂贵，且对实验员要求较高，普通的质量控制以及检测类实验室通常较难实现；而正相方法只能分开测定维生素A、D、E。所以需要两台仪器进行兼顾，不但成本高、易受流动相等条件影响，同时检测过程繁琐、耗时长。

在线SPE二维液相色谱法分析乳制品中维生素A、D、E

作为全球领先的分析仪器制造商，沃特世不仅提供性能优异的产品，解决方案的开发同样出色。本方案从以下4方面入手，创新性地开发了在线SPE二维液相色谱法分析乳制品中的脂溶性维生素A、D、E。

简化维生素D分析的繁琐过程：

维生素D（麦角醇），在乳制品中主要存在两种异构体: 维生素D₂（麦角钙化醇）、维生素D₃（胆钙化醇），其中维生素D₃生理活性强于维生素D₂。

需要对维生素A进行异构体分析：

维生素A（视黄醇），在乳制品中主要存在的异构体: 全反式视黄醇、13-顺式视黄醇。

对维生素E的4种生育酚异构体和4种三烯生育酚异构体的分析：

维生素E（生育酚和三烯生育酚）主要存在5种异构体：生育酚: α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、α-三烯生育酚。天然的生育酚与合成的生育酚存在手性上的差别。

简化脂溶性维生素A、D和E分析的预处理过程：

在线SPE二维液相分析的仪器配置和工作流程如图1所示：

图1. 在线SPE二维液相色谱仪器配置和工作流程图。

本系统采用了3个泵、1个进样器、1个检测器、1个色谱柱管理器和1个SPE切换阀的配置，显著节省了所需成本。一维和二维共用一个检测器，节约成本的同时，所有信号产生在同一张色谱图上，方便数据处理和数据阐述。另外，在线SPE采用卡套式结构，其柱芯可拆卸和更换，降低了维护难度和使用成本。

在线SPE二维液相分析乳制品中维生素A、D、E的参考色谱条件

仪器：

ACQUITY Arc

方法：

色谱柱与色谱相

在线SPE: Waters HLB 2.1x25 mm带柱套固相萃取柱；
一维(维生素A、D、E): PFP 4.6x150 mm, 3 μm；H₂O:MeOH=5:95；
二维(维生素D₂和维生素D₃): PAH 2.1x100 mm；H₂O:CAN=4:96；
二维(维生素A异构体): PAH 4.6x100 mm, 3 μm, H₂O:MeOH=15:85或者OD 4.6x150 mm，MeOH:H₂O=20:80；
二维(维生素E手性分离): 4.6x150 mm，3 μm；H₂O:MeOH=18:82。

梯度条件

一维梯度条件
二维梯度条件

实验结果

维生素A、D、E标准品测试：

图2. 维生素A、D、E标准品的在线SPE二维液相分析结果。

从图2可以看出，采用在线SPE技术，可以实现样品皂化液的直接上样分析，极大地简化了样品前处理流程，满足实验室日常检测的高通量需求。同时，沃特世独特的Oasis HLB固相萃取填料作为在线SPE的柱芯，非硅胶基质的聚合物特性能够耐受极高pH值皂化液的反复进样而保持性能的稳定性。

乳制品中维生素A、D、E生物活性异构体的分析

在实际乳制品检测中，我们发现维生素A、D、E的浓度水平差距较大，同时检测似乎没有必要。此外，我们将目光集中在那些更感兴趣、且相对生物活性较高的异构体上。为此我们在这套在线SPE二维液相色谱系统上，用相同的配置进行了3组不同的方法学考察。

配方奶粉中维生素D2和D3的分析