分析化学｜NIR-II荧光探针，通过荧光/光声成像和生物标志物触发的药物释放来检测和治疗食物添加剂相关肝损伤

恒光智影

2022.5.24

作者上海恒光智影医疗科技有限公司

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本文要点：食品添加剂在食品生产中是必不可少的，在食品加工或准备过程中亚硝酸盐（防腐剂）和胺会反应生成亚硝胺，亚硝胺是一种剧毒物质已知会引起肝毒性甚至癌症。准确检测亚硝胺导致的急性肝损伤有助于制定最佳治疗方案，避免病情进一步恶化。本文开发了一种可激活的探针BHC-LUT，在原位肝脏生物标志物H2O2的触发下，可以释放药物木犀草素进行治疗，同时形成生色团（BHC-OH）用于NIR-II荧光成像和多光谱光声层析（MOST）成像。

以苯并吲哚七甲基菁为生色团骨架，在苯并吲哚基团上引入三甘醇，提高探针的水溶性和生物相容性；通过硼酸键将木犀草素偶联到发色团上，其中硼酸既是H2O2的响应基团，又是荧光的淬灭剂。当探针BHC-Lut通过静脉注射到DEN诱导肝损伤的小鼠体内，此时小鼠肝脏中存在H2O2，探针BHC-Lut中硼酸识别到H2O2，释放出药物木犀草素进行治疗，同时释放出荧光团BHC-OH用于NIR-II荧光成像和MOST成像。

图1. A）探针BHC-Lut（5μM）与H2O2（0、5、10、20、30、45、60和80μM）反应25min前后的吸收光谱。插图：830 nm处的吸光度与H2O2浓度的函数关系；B）探针BHC-Lut（20μM）与H2O2（0、50、100、120、200和300μM）反应25min前后的荧光光谱。插图：930nm处的荧光强度与H2O2浓度的函数关系；C）探针BHC-Lut（20μM）在不同时间（0、1、3、6、10、15、20和25min）与H2O2（300μM）反应后的荧光光谱。插图：930 nm处的荧光强度随时间变化；D）探针BHC-Lut（20μM）的相对OA强度与H2O2水平(0、20、40、80、160、320μM)之间的关系。插图：探针BHC-Lut与不同水平的H2O2反应后的光声图像；E）探针BHC-Lut（10μM）中与不同剂量的H2O2作用不同时间（0，5，10，20，40，60，80min）前后木犀草素的累积释放百分比；F）探针BHC-Lut（20μM）在不同生物相关物质中荧光强度（930 nm）的比率。a.空白，b.H2O2（300μM），c.谷胱甘肽（1mM），d.半胱氨酸（1mM），e. L-异亮氨酸（1mM），f.谷氨酸（1mM），g.酪氨酸（1mM），h.丙氨酸（1mM），i.葡萄糖（1mM），j.精氨酸（1mM），k.NaNO2（1mM），l.NaClO（300μM），m. Na+（1mM），n. K+（1mM），o. Ca2+（1mM），p. Mg2+（1mM）。激发波长：808 nm

首先利用光谱测量研究探针BHC-Lut对于H2O2的光学性质。如图1A和1B所示，在没有H2O2存在时，探针BHC-Lut的荧光强度是很低的；随着H2O2的水平增加，探针BHC-Lut的吸光度和荧光强度逐渐增强。另外，随着探针BHC-Lut与H2O2反应时间增长，荧光强度也随之增强（图1C）。如图1D所示，探针BHC-Lut与不同浓度的H2O2反应，随着H2O2水平增高，探针BHC-Lut的光声信号随着增强。结果表明探针BHC-Lut可以响应H2O2，并且可以产生用于检测H2O2的荧光成像和光声信号。

为了评估通过响应H2O2释放药物的能力，将不同水平的H2O2与探针BHC-Lut共孵育，在不同时间时评估药物的累积释放百分比。如图1E所示，与100μM H2O2共孵育的探针BHC-Lut将木犀草素快速释放，而未经H2O2处理的探针释放木犀草素的速度非常慢。接下来进一步研究探针BHC-Lut对H2O2的响应选择性，将探针BHC-Lut与不同的生物相关物质共孵育25min，检测在930nm处荧光强度的比率。如图1F所示，与H2O2共孵育的探针BHC-Lut显示出明显的荧光增强，相反与其他生物相关物质共孵育的探针BHC-Lut只有微小的荧光强度变化，表明探针BHC-Lut具有良好的H2O2响应选择性。

图2. A）对照组（健康小鼠）和模型组（小鼠分别腹腔注射DEN剂量为50mg kg-1、100mg kg-1 、200mg kg-1）在静脉注射探针BHC-Lut（2.25 mg kg-1）后不同时间点时（0、15、25、35、45、60 min）的NIR-II荧光成像。对仰卧位的小鼠进行成像。绿色虚线表示肝脏区域的ROI。激发光（808nm, 60mW cm-2）。在卤素光照射下拍摄明场图像；B）图2A中ROI的平均NIR-II荧光强度；C）模型组和对照组小鼠10天内的相对体重（n=5）

为了研究探针BHC-Lut在内源性H2O2导致的急性肝损伤中的检测和成像，首先通过腹腔注射DEN，建立DEN导致小鼠肝损伤的模型，通过注射不同DEN的剂量建造不同程度的肝损伤。通过H&E染色分析发现，与对照组相比，DEN高剂量组小鼠肝细胞空泡肿胀加重，并且随着DEN剂量的增加肝损伤加重。接着通过荧光成像进一步研究，如图2A和2B所示，在静脉注射BHC-Lut25min后，小鼠肝区域的荧光信号清晰可见，并且随着时间增长和DEN剂量增多荧光强度逐渐增强。此外，随着DEN的剂量增多，小鼠相对体重逐渐下降，进一步表明了DEN的毒性（图2C）。

图3. A）探针BHC-Lut（2.25mg kg-1）静脉注射0和60min后模型组和对照组的MOST横断面成像。脊髓标记为“1”。白色虚线表示肝脏区域的ROI；B）3A中ROI区域的平均MOST强度（n=5）；C）模型组和对照组小鼠血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）的水平（n=5）；D）探针BHC-Lut（2.25mg kg-1）静脉注射0和60min后模型组和对照组的3D MOST成像。脊髓标记为“1”。白色虚线表示肝脏区域

接下来通过MOST成像进一步研究探针BHC-Lut在内源性H2O2导致的急性肝损伤中的检测和成像，如图3A和3B所示，与对照组相比，模型组小鼠在静脉注射探针BHC-Lut后，随着时间增长和DEN剂量的增多，MOST强度逐渐增强；注射后60min后，肝脏区域出现明显的MSOT信号。图3C所示的是小鼠ALT的水平，注射高DEN剂量的小鼠ALT水平显著升高，并且明显高于对照组，进一步证实了高DEN剂量会导致更严重的肝损伤。此外，如图3D所示，静脉注射探针BHC-Lut 60min后，高DEN剂量组小鼠肝脏MSOT信号明显高于对照组。MSOT成像结果与NIR-II成像结果一致，证明了急性肝损伤的程度随DEN剂量的增加而加重。

图4. A）在3次或6次注射治疗后，对四组进行NIR-II荧光成像。对照组：健康的小鼠，生理盐水组：模型小鼠用生理盐水治疗，木犀草素组：模型小鼠用木犀草素（1.02mg kg-1）治疗，探针组：模型小鼠用探针BHC-Lut（4.5mg kg-1，相当于1.02mg kg-1的木犀草素）治疗。对仰卧位的小鼠进行成像。激发波长为808nm。绿色虚线表示肝脏区域的ROI。在卤素光照射下拍摄明场图像；B）在3次或6次注射治疗后，对四组进行MSOT横断面成像。脊髓以“1”表示。对俯卧位的小鼠进行成像。白色虚线表示肝脏区域的ROI；C）图4A中第3天或第6天中ROI区域的平均NIR-II荧光强度（n=5）；D）图4B中第3天或第6天覆盖肝脏区域的ROI的平均MOST强度（n=5）；E）第3天和第6天小鼠的血清丙氨酸氨基转移酶水平（n=5）

为了探讨探针BHC-Lut对DEN所致小鼠急性肝损伤的治疗作用，通过腹腔注射将DEN （100mg kg-1）注入小鼠体内，建立小鼠急性肝损伤模型。如图4A和4C所示，无论是第3天还是第6天，探针组小鼠的肝脏区域的NIR-II荧光信号都明显弱于生理盐水组和木犀草素组，接近于对照组的NIR-II荧光信号，表明探针BHC-Lut对于肝损伤具有良好的治疗效果。之后进行H&E染色的组织学分析和小鼠体重的研究，进一步验证了探针BHC-Lut对于肝损伤的治疗作用。

如图4B和4D所示，相比于生理盐水组和木犀草素组，探针组小鼠的肝脏区域的光声信号明显较弱，与对照组的光声信号相近。MOST成像数据与NIR-II成像数据一致，表明了探针BHC-Lut对于肝损伤具有良好的治疗效果。此外，探针组小鼠的ALT水平明显低于生理盐水组和木犀草素组，与对照组ALT水平接近（图4E），进一步验证了探针BHC-Lut的治疗能力。

总结：本文开发一种可激活的探针，通过对原位肝脏生物标记物H2O2的响应，实现对食物添加剂引起的肝损伤进行NIR-II成像和MOST成像，同时释放治疗药物木犀草素。探针BHC-Lut不仅可以用于小鼠肝损伤的检测，而且可以提供对肝损伤的治疗。提供了一种治疗策略：通过响应生物标记物释放生色团和药物，实现对疾病的检测和治疗。

参考文献

https://doi.org/10.1016/j.aca.2022.339831

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