本文要点：新冠病毒（SARS-CoV-2）的早期发现是预防其传播的有效途径。新冠病毒抗原检测是便捷的方法，但如何发展高灵敏度的有效诊断方法仍是一个挑战。本文提出了一种基于近红外二区窗口荧光发射纳米颗粒的横向流动分析方法( lateral flow assay，LFA)，用于新冠病毒抗原的灵敏检测。得益于NIR-II荧光的高穿透性和低自体荧光，这种NIR-ⅡLFA可以增强SBR，使得SARS-CoV-2抗原的检测限可降至0.01 ng·mL-1。在临床拭子样本测试中，NIR-II LFA优于胶体金LFA，与聚合酶链反应测试的总体一致性更高。NIR-II LFA可以成功检测低抗原浓度(0.015 ~ 0.068 ng·mL-1)的临床标本，而胶体金LFA检测失败。NIR-II LFA可为新冠肺炎感染的早期诊断和大规模筛查提供一个高灵敏度、快速、经济有效的平台。
NIR-II荧光纳米颗粒是通过将有机染料封装在聚苯乙烯(PS)纳米颗粒中制备的。纳米颗粒表面修饰的羧基，允许与胺功能化的单克隆抗体(mAbs117)进行偶联。与mAbs117偶联后，纳米颗粒(NIR-II nanoparticles@mAbs117)尺寸增大47 nm、表面变粗糙(Figure 1(a))。制备的纳米颗粒分散在水中呈淡绿色，并显示明亮的NIR-II荧光(Figure 1(b))。其紫外-可见-近红外(UV-Vis-NIR)吸收光谱在806 nm处出现峰值，而荧光发射光谱在1046 nm处出现峰值(Figure 1(c))。
纳米颗粒对于新冠病毒抗原进行LFA检测的原理如Figure 2 所示。LFA条带由5部分组成:样品垫（Sample pad）、结合垫（Conjugate pad）、NC膜（NC membrane）、吸收垫（Absorbent pad）和塑料衬底（Plastic backing）。NIR-II nanoparticles@mAbs117被固定在结合垫上。将N蛋白捕获抗体(mAbs30)和链霉亲和素分别置于NC膜上的测试线(T线)和控制线(C线)上，T线和C线之间的间隙约为3 mm。样品液被滴加到样品垫上后，在毛细力作用下流向吸收垫。在流动过程中，样品中新冠病毒N蛋白将与结合垫上的nanoparticles@mAbs117形成 nanoparticles@SARS-CoV-2 N蛋白复合物。由于新冠病毒N蛋白与mAbs30之间的抗原抗体相互作用，该复合物在T线上被mAbs30抗体捕获，形成三明治免疫复合物结构。样品中N蛋白越多，在试验线上聚集的夹心免疫复合物越多。随着样品继续流动，生物素标记的nanoparticles@mAbs117被链霉亲和素捕获在C线上。在808 nm激发并在1000 nm长通滤波器滤波后，可使用低成本的InGaAs光电探测器在室温下记录荧光信号。荧光信号与纳米颗粒的数量呈正相关。通过对T线和C线的荧光信号强度积分，建立抗原浓度与荧光强度的对应关系，可以得到定量的样品浓度。基于此原理，建立了一种高灵敏度的SARS-CoV-2抗原横向流动检测方法，可用于SARS-CoV-2抗原的定量早期诊断。
优化筛选出NIR-II nanoparticles@mAbs117的抗体载量和免疫测定时间为240 ng·mL-1和15min。随后，通过检测不同浓度的新冠病毒重组抗原，评估LFA的灵敏度。随着N蛋白浓度的增加，T/C信号强度相应增加(Figure 3(a))。T/C强度与N蛋白浓度在0.02-120 ng·mL-1范围内呈良好的线性关系。在检测阈值附近进行了一系列低浓度实验。通过空白加三倍标准差的平均信号强度计算，LoD降至0.01 ng·mL-1(Figure 3(b))。再现性是评价方法有效性的关键因素。在N蛋白浓度为0.5、10和100 ng·mL-1时，回收率估计分别为102.6%、98.9%和109.1%(Figure 3(c))。通过检测甲型流感、乙型流感、S蛋白(SARS-CoV-2重组刺突蛋白)和N蛋白，验证了条带的特异性。结果表明，本研究的条带可以特异性识别新冠病毒，并且与其他蛋白没有交叉反应(Figure 3(d))。
从低抗原浓度的检测中发现，T线与背景信号区分明显：当抗原浓度降低到0.1 ng·mL-1时，SBR高达3.46；当抗原浓度低至0.01 ng·mL-1时，SBR仍可达到1.21，但T线看起来比较模糊(Figure 4(a))。与商业胶体金分析试剂盒进行比较，在用相同抗体制备的胶体金检测试剂盒中：当抗原浓度稀释到0.1 ng·mL-1时，T线不明显；而0.5 ng·mL-1时SBR仅为1.23(Figure 4(b))。另一种商业胶体金型新冠病毒抗原试剂盒，当抗原浓度稀释至0.5 ng·mL-1时，T线不清晰。结果提示NIR-II LFA检测新冠病毒抗原的敏感性高于胶体金LFA。
为进一步验证NIR-II LFA的有效性，研究采集了30份临床拭子样本，包括18份COVID-19阳性样本和12份COVID-19阴性样本(由深圳疾病预防控制中心PCR证实)。通过比较荧光强度分布曲线可以清楚地区分阳性样品和阴性样品。其中10例抗原浓度较低，范围为0.015 ~ 0.068 ng·mL-1(Figure 5(a))。我们测试了相同条件下胶体金检测方法 (WWHS Biotech, Inc.)。18份阳性样本中仅检出8例抗原浓度较高的病例(Figure 5(b))，其余10例抗原浓度较低无法与阴性样品区分。如Figure 5(c)所示，NIR-II LFA优于胶体金LFA，因为它可以减少假阴性样品的数量。需要指出的是，标本保存液和保存时间可能会影响临床标本抗原定量的准确性。目前的结果表明，NIR-II方法在疑似病例或早期感染的情况下可以实现更敏感的COVID-19检测，但仍需要对临床COVID-19样本进行更详细的研究，以供未来应用。
参考文献
https://doi.org/10.1007/s12274-022-4351-1
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近红外二区小动物活体荧光成像系统 - MARS
NIR-II in vivo imaging system
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