摘要
小干扰 RNA (siRNA) 可有效沉默癌症中的关键分子途径。该工具作为治疗方式受制于缺乏智能化载体系统来增强该分子向体内特定目标的优先递送。在本研究中，是通过由腹腔注射给药非小细胞肺癌模型小鼠，对递送的新型抗 NTSR1-mAb功能化抗突变体K-ras siRNA 混合纳米颗粒和裸 siRNA 制剂进行了体内行为的研究对比。抗NTSR1-mAb功能化混合纳米颗粒中的 siRNA 优先在带肿瘤的肺和转移的肿瘤中积累至少 48 小时，而裸 siRNA 制剂显示在所有监测的器官中缺乏优先积累。纳米颗粒递送的siRNA的血浆末端半衰期是裸siRNA制剂的 11 倍（17-1.5 小时）。平均停留时间和AUClast分别比相应的裸 siRNA 制剂高 3.4 倍和 33 倍。HPLC表明，混合纳米颗粒载体系统保护封装的 siRNA 免受体内降解。我们的新型抗NTSR1-mAb功能化混合纳米颗粒为体内靶向 siRNA 提供了一个有用的平台，即可用于实验和也可用于临床目的。
关键词：siRNA；纳米颗粒；Clarity OTX；Clarity Oligo-RP；HPLC
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样品信息
siRNA
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实验部分（仪器、试剂与材料）
1
主要仪器设备
HPLC
2
试剂材料
乙腈、三乙胺、乙酸质谱纯
3
样品制备
根据制造商的说明，用Clarity OTX 试剂盒（Phenomenex）分离血液和组织中的 siRNA 用于 HPLC。简而言之，将等份 Clarity OTX 加载缓冲液与血浆样品混合，然后加载到固相萃取柱上。固相萃取分离柱（Clarity OTX 100 mg/3 mL Phenomenex）首先用甲醇润湿，然后在上样前用 Clarity 平衡缓冲液（10 mmol/L 磷酸盐，pH 5.5）进行平衡。对于组织样品，它们首先在 0.1 mol/L Tris 缓冲液（pH 8.0）中均质化，然后与等量的裂解加载缓冲液混合。上样后，将平衡缓冲液加入小柱中冲洗两次，然后用 Clarity OTX 洗涤缓冲液（10 mmol/L 磷酸盐，pH 5.5/50% 乙腈）冲洗。然后加入洗脱缓冲液（100 mmol/L 碳酸氢铵，pH 8.0/40% 乙腈/10% 四氢呋喃）以从柱中洗脱 siRNA。然后将样品快速真空蒸发至100 μL，用于液相色谱分析。
4
HPLC色谱条件
色谱柱： Clarity Oligo-RP 3μm (50 *2.0 mm, Phenomenex)
流动相A：20mM三乙胺-乙酸缓冲盐溶液，pH 7.0；
流动相B：乙腈；
流速：200 μL/min；
柱温：25 ℃
进样量：1 µL
流动相梯度：见表1
表1 流动相梯度表
时间 (min) | A% | B% |
0 | 95 | 5 |
10 | 80 | 20 |
10.01 | 95 | 5 |
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实验结果
图1 体内稳定性研究。
腹腔注射荷瘤小鼠 (a) 裸 siRNA 和 (b)后混合纳米颗粒递送的siRNA 25 小时后的高效液相色谱图。DS siRNA，双链 siRNA。
图2 siRNA 血浆浓度随时间的变化。
以抗 NTSR1-mAb 功能化纳米粒子或裸 siRNA 形式给予荷瘤小鼠单剂量 0.9 mg/kg 抗突变 K-ras siRNA。n = 3。
图3 体内生物分布研究。
腹腔注射后抗突变 K-ras siRNA 的生物分布 在（a）功能化混合纳米颗粒siRNA和（b）裸siRNA。肺数据在统计上与同一时间点组织中的下一个最高积累进行了比较。*P ≤ 0.05、**P ≤ 0.01 和 ***P ≤ 0.001。n = 3。
表1 裸siRNA和负载siRNA的抗NTSR1-mAb功能化杂化纳米颗粒在转移性原位非小细胞肺癌SCID模型中的关键药代动力学参数
结论：
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抗 NTSR1-mAb 功能化的杂化纳米颗粒能够驱动 siRNA 在荷瘤小鼠中的药代动力学和生物分布。与裸 siRNA 制剂相比，这些纳米载体能够显着降低 siRNA 在血浆中的清除率并增加循环时间。抗NTSR1-mAb功能化混合纳米颗粒能在48小时内选择性递送siRNA至携带肿瘤的肺中。混合纳米粒子还保护封装的 siRNA 在体循环中免于降解。因此，这些新型杂化纳米粒子可以作为有效的非病毒载体用于 siRNA 递送。
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本文引用于Molecular Therapy—Nucleic Acids (2016) 5, e282; doi:10.1038/mtna.2015.56; published online 26 January 2016
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