使用H.E.L BioXplorer系统在1至4bar的压力下对钩虫贪铜菌H16进行发酵，使用二氧化碳或糖作为唯一的碳源。
Dr. Tuck Seng Wong a, Dr. KangLan Tee a, Dr. Jasbir Singh b, Dr. Mark Appleton b
a - University of Sheffield, Sheffield, S1 3JD
b - H.E.L Ltd, 9-10 Capital Business Park, Borehamwood, WD6 1GW
摘要
Abstract
在本研究中，H.E.L BioXplorer被用来评估自养模式或异养模式下的微生物发酵。在自养栽培中，可通过升高的气体压力提升更高的生物质生产速率来直接改善工艺经济性。气体溶解度和气液传质的大幅增加表明，体系同时实现了对溶解氧曲线的精细控制，这已应用于生物燃料和生物酒精生产方面。在容积通常为100mL以上的发酵罐和高达60psi（约4bar）的工作压力范围内，使用CO2/H2作为气体原料的自养栽培的生物量生产率与使用葡萄糖酸盐作为碳源的异养栽培相当。
BioXplorer 5000P
1引言
许多生物工艺的商业可行性可能取决于气体转移的速度，当气体的溶解度很差，这一点尤其正确。例如，在利用废气生产燃料和化学品的气体发酵过程中，使用氢气和甲烷等气体时，对于气体转移不畅的工程解决方案通常仅限于通过改变喷气和搅拌来增加kLa。这提供了非常有限的改进空间；因此，许多潜在的有趣的过程可能会变得不经济。一个更有效的替代方法是在高压下操作生物反应器，因为这可以在不改变喷射或搅拌的情况下将气体传输率提高数倍。
要进一步提高增长率以证明对规模化使用的投资的合理性，仍需要克服一些挑战。这些挑战包括，但不限于：气体密度低，气体溶解度低（CH4、H2、O2~1 mmol/kg水，CO2~30 mmol/kg水）和C1气体转移速度慢，这都会限制净转化率。增加发酵的压力将有助于加快气体转移。
2
材料和方法
钩虫贪铜菌是一种广泛认可的将C1来源转化为一系列不同有机物的转换器。底物的转化取决于具体的菌株，以及对菌株的基因改造。本研究中使用的菌株是钩虫贪铜菌H16，这是一种常见于土壤和淡水中的非致病性细菌，具有生产多羟基烷酸酯生物塑料的内在能力。该菌株以葡萄糖酸盐和二氧化碳作为碳源生长。正因为如此，发酵是在异养和自养的条件下进行的。
一共测试了10种发酵条件，如表1所总结的。除非另有说明，发酵是在30℃下进行的，使用的是在含有1%葡萄糖酸钠的MSM合成培养基中制备的接种物。培养开始时，将发酵液接种到OD600 = 0.3。使用0.2 M NaOH和0.2 M H2SO4将发酵液控制在pH 6.8。
表1 培养条件
#碳源
压力(bar)
气体成分
气体流速(ml/min)
搅拌速率
(rpm)
备注1
葡萄糖酸盐
1
100% Air
100
600
无pH 监测/控制
2
葡萄糖酸盐
2
700
600
-3
葡萄糖酸盐
4
600
700
无 DO 监测，无细胞生长
4
葡萄糖酸盐
1
100
600
-5
葡萄糖酸盐
3
500
600
压力增加速率1bar/min
6
CO2
1
85% H2
5% O2
10% CO2
500
600
在OD600≈1的情况下，12小时后清空O2瓶，重复运行
7
CO2
3
500
600
-8
CO2
3
500
600
使用自养式预培养
9
CO2
4
500
600
在早期指数期的5天后停止生长
10
CO2
2
500
600
可能由于预培养物过旧而没有生长
BioXplorer设置:pH值(探头:Hamilton，Polilyte Plus XP)、溶解氧(探头:Hamilton，VisiFerm DO Arc 120)、浊度(探头:Anglia Instruments，浊度探头SS316)、温度(探头:Helium，PT100 A级4线)和生物量(探头:ABER，FUTURApico)。所有参数都被连续监测，并通过H.E.L的WinISO软件自动调整。除了计算出的OD600值，所有显示的数据都是从WinISO软件中导出。
BioXplorer AutoMATE
3
结果和讨论
在所有的异养发酵（运行#1-#5）中都观察到了细胞的生长，除了#3是在4bar条件下运行的，在最后的培养中没有活细胞。观察到的最大生长速度是4号发酵的0.326/小时（图1）。高效液相色谱分析表明，葡萄糖酸盐在发酵结束时被完全消耗。
Figure 1 – Fermentation #4
Figure 2 – Fermentation #6
在压力下的自养性培养是通过以1bar为单位增加压力并在每一步增加后保持20分钟来实现的。发酵过程#6（图2）和#7（图3）显示如下。
Figure 3 – Fermentation #7
Figure 4 – Growth curve of C. necator H16 in gas fermentation and during heterotrophic growth
如图4所示，所有的自养生长速度都比1bar下的异养生长速度慢（#4）。将压力从1bar增加到3bar，生长速度增加了166%。然而，与1bar相比，增加压力到4bar时，生长速度明显下降到24%。这表明，钩虫贪铜菌H16的耐压性可能是在4bar左右。进一步的工作将是必要的，以增加钩虫贪铜菌在实验室的耐压性，这也可以用BioXplorer进行。
4结论
H.E.L BioXplorer成功地被用来研究压力对钩虫贪铜菌H16在异养和自养条件下生长的影响。即使压力从11bar增加到3bar，异养条件下的生长仍然是可行的。这并不奇怪，因为在所有的压力下，葡萄糖酸的碳源都很容易获得。然而，在自养条件下，与1bar相比，压力达到3bar时，生长率明显增加到166%。
使用H.E.L BioXplorer清楚地显示了在压力下进行发酵的好处。因此，使用高压进行微生物发酵有可能使自养性生长在经济上是可行的。
5鸣谢
我们要感谢Wong博士、Tee博士和他们的团队完成了这项工作，并与我们分享这些数据。我们与谢菲尔德大学的研究合作得到了BBSRC C1Net BIV、BBSRC IAA和RAEng的支持。The Leverhulme Trust Senior Research Fellowship（授予黄博士，H.E.L.为工业伙伴）。
BioXplorer 100
BioXplorer 400
6
典型客户
客户名称国家设备型号Human TechnopoleItalyBioXplorer 100MerckUSABioxplorer 400P XLAberystwyth UniversityUKBioXplorer 100University of CologneGermanyBioXplorer 100Electrochaea GmbHGermanyBioXplorer 5000PUniversity of ChicagoUSABioXplorer 5000浙江大学中国BioXplorer 5000CHr HansenDenmarkBioXplorer 100Universidad Politécnica de Madrid (UPM)SpainBioXplorer 100University College Cork, Ireland University College CorkIrelandBioXplorer 400
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